昆虫细胞-杆状病毒系统分泌表达的猪瘟病毒E2 蛋白及其免疫原性研究

王遵宝，贺 笋，李俊辉，刘 宏，豆智华，郑 侃，李森江，寇 春

（天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830032）

猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性烈性传染病，给中国和其他许多国家养猪业造成重大经济损失。虽然中国利用自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗进行强制免疫，有效控制了猪瘟的大规模流行，但猪瘟仍在中国部分地区呈散发、周期性流行。近年来的研究结果表明，CSFV 基因2 群已取代1 群，成为我国猪瘟流行的优势基因群，临床中以慢性、非典型性猪瘟为主要表现形式，对养猪业的健康发展造成极为严重的危害[1-4]。Luo 等报道在华东地区温和型猪瘟散发的猪场分离获得了2.1d 亚型CSFV，攻毒结果表明猪瘟活疫苗对该株病毒只能提供临床保护，经病理解剖及免疫组化分析证实免疫猪存在组织损伤，荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示免疫猪攻毒后存在排毒和带毒情况，提示猪瘟活疫苗不能完全抵抗2.1d 亚型CSFV 对猪的攻击[5]。 此外，由于猪瘟兔化弱毒疫苗在制造时易受BVDV、支原体、圆环病毒等血清外源病原污染，且在临床使用过程中受母源抗体干扰较大，无法克服免疫耐受等问题，而且使用猪瘟活疫苗免疫后，无法用血清学方法快速鉴别疫苗免疫和CSFV 野毒感染的猪，是我国猪瘟净化面临的关键科学难题[6-7]。因此有必要研制保护谱广、安全、可靠，不会与野毒发生重组变异、可进行鉴别诊断的新型标记猪瘟疫苗。研究表明，CSFV E2 蛋白位于病毒的囊膜表面，参与病毒的感染过程，是CSFV 的主要保护性抗原蛋白之一，能诱导机体产生中和抗体[8]。为研制、开发对不同亚群CSFV 均有保护力的猪瘟E2 亚单位疫苗，本研究以猪瘟兔化弱毒株（Hog cholera lapinized virus，HCLV）的E2 基因为基础，参考近年来国内CSFV 流行株的E2 基因序列，并根据昆虫细胞密码子偏嗜性、简并性对其进行优化，使其与CSFV 基因1、2群病毒株的E2 基因编码的氨基酸同源性最高，以提高E2 蛋白对不同亚群病毒株的交叉保护性。经基因合成、构建重组转移载体及穿梭载体，最终将E2 基因转染至杆状病毒中，获得了CSFV E2 重组蛋白（Bac-E2），并利用猪瘟抗体阴性猪评价了该蛋白的免疫原性及保护效力，为猪瘟亚单位疫苗的开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 优化的CSFV E2 基因序列由上海英骏生物技术有限公司合成；SF9 细胞、High Five 细胞、PK-15 细胞、HCLV 细胞适应株、猪瘟活疫苗（传代细胞源）等均由天康生物股份有限公司传代、保存和提供；CSFV 石门强毒株、猪瘟阳性血清购自中国兽医药品监察所菌毒种保存保藏中心。

pFastBac1 载 体、DH5s、DH10Bac 感 受 态 细 胞、Cellfectin 转染试剂盒等均购自美国Invitrogen 公司；Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、ExTaq DNA聚合酶、PCR Mix、Xho I、EcoR I 内切酶等均购自宝生物（大连）工程有限公司；兔抗猪IgG-HRP、兔抗猪IgG-FITC 均购自Sigma 公司；His TrapTMHP 预装柱购自GE 公司；ISA 660VG 佐剂购自法国赛彼科公司。4 周龄～5 周龄CSFV 中和抗体阴性猪，购自新疆天康畜牧科技有限公司。

1.2 重组转移质粒pFast-E2 的构建及鉴定 以HCLV 为基础，同时参考近年来国内CSFV 流行株的E2 基因序列，根据昆虫细胞密码子偏嗜性对其进行优化和修饰，并在其N 端引入保护碱基、酶切位点、包含ATG 的Kozak 转录起始序列及6-His Tag后，由上海英俊生物技术有限公司合成。将人工合成的E2 基因序列经EcoR I、Xho I 双酶切后克隆至转移载体pFastBac1 中构建重组质粒pFast-E2，并经测序鉴定。将其进一步转化至含有穿梭杆粒的DHl0Bac 感受态细胞，经PCR 鉴定获得重组杆粒Bac⁃mid-E2。参考Cellfectin 转染试剂盒说明书，将其转染于生长状态良好的SF9 细胞，27 ℃恒温培养72 h～96 h 待细胞出现病变后，收集上清，提取核酸进行PCR 扩增并测序鉴定，将其作为第一代重组杆状病毒，记为P1，命名为：Rb-E2。以10%接种比例分别在SF9细胞中盲传、扩增，至P5代时收集上清用于后续试验及检测。重组病毒的PCR 鉴定引物序列如下：E2-F1：5'-CACCATGGCATTTCTCATCTGCTTGGT A-3'/E2-R1：5'-AAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTG-3'

1.3 重组杆状病毒的间接免疫荧光试验（IFA）鉴定将1.2 收获的重组杆状病毒P5 代，10 倍倍比稀释后接种于96 孔板中生长状态良好的SF9 细胞，以不接种病毒的SF9 细胞作为阴性对照，7 d 后用4%甲醛固定，以猪瘟阳性血清（1∶500）为一抗，兔抗猪IgG-FITC（1∶5 000）为 二 抗 经IFA 鉴 定 重 组 病 毒Rb-E2 及检测重组E2 蛋白（Bac-E2）的表达，根据Reed-Muench 法计算重组病毒病毒含量[9]。

1.4 重组蛋白的western blot 鉴定重组病毒 将1.2收获的重组杆状病毒P5 代，根据病毒含量测定结果，以MOI 2 接种生长良好的High Five 悬浮细胞，27 ℃恒温培养，在接种病毒后60 h、72 h、84 h、96 h，分别取细胞上清样，进行SDS-PAGE 检测。以猪瘟阳性血清（1∶500）为一抗，兔抗猪IgG-HRP（1∶5 000）为二抗，经western blot 鉴定重组病毒及Bac-E2 蛋白的表达，通过SDS-PAGE 电泳后经灰光度值法测定表达的Bac-E2 蛋白的浓度。

1.5 重组Bac-E2 的免疫效力评价

1.5.1 动物实验设计 用摇瓶培养High Five 悬浮细胞，接种Rb-E2，大量制备抗原；接种病毒后96 h，离心取上清，用镍亲和层析法纯化Bac-E2 蛋白。将Bac-E2 蛋白与ISA 660VG 佐剂等质量混合后乳化免疫猪，以健康High Five 细胞上清液乳化制剂免疫的猪为阴性对照，同时以猪瘟活疫苗（HCLV，传代细胞源）免疫的猪作为阳性对照。参照《猪瘟活疫苗（兔源）质量标准》附注中“猪瘟病毒中和试验方法”筛选4 周龄～5 周龄猪瘟抗体阴性猪15 头，动物分组及免疫方案见表1[10]。

1.5.2 各组猪中和抗体的测定 首免后每周采血，连续5 次，无菌分离血清；将待测血清样品置56 ℃水浴槽中灭活30 min；用MEM 培养基连续2 倍倍比（1∶4～1∶4 096），取50 μL 加入96 孔板，每个浓度设8 个重复孔；在每孔中加入HCLV（200 TCID50/50 μL/孔），以MEM 培养基为阴性对照，猪瘟阳性血清作为阳性对照，37 ℃中和1 h。另取一个96 孔板进行病毒含量的回归滴定，每孔加入50 μL MEM，将稀释的HCLV（200 TCID50/50 μL）连续2 倍倍比（1∶4～1∶4 096），以MEM 培养基作为阴性对照。在以上两块96 孔板的每孔加入密度为105个/mL 的PK-15 细胞悬液100 μL，37 ℃、5%CO2培养3 d 后，用甲醛固定，以猪瘟阳性血清（1∶500）为一抗，兔抗猪IgG-FITC（1∶5 000）为二抗，在倒置荧光显微镜观察荧光，以Reed-Muench 法计算各组猪血清的中和抗体滴度和病毒含量。回归滴定的病毒含量在50 TCID50/50 μL～300 TCID50/50 μL 时所稀释的病毒符合检验要求，判定的血清中和抗体成立。

1.5.3 免疫效力试验 Bac-E2 组、HCLV 组和阴性对照组猪均在首免后35 d，经耳后颈部肌肉注射CSFV 石门强毒（105.0最小致死剂量/头，即105.0MLD/头），攻毒后连续观察16 d，每天测温、记录各组猪的发病和死亡情况，死亡猪剖检后观察各组织的病变情况，并计算免疫组的保护率。攻毒后每4 d 采集各组猪的咽拭子及肛拭子，冻存于-80 ℃冰箱，常规处理后提取病毒核酸，反转录成cDNA 后，采用RT-qPCR 检测各组猪排毒情况[11]。

表1 实验设计Table 1 The experimental design

2 结 果

2.1 重组杆状病毒的PCR 鉴定结果 构建的重组质粒pFast-E2 经测序结果显示，该E2 基因与HCLV的亲缘关系较近，同源性达95.2%，同属于1.1 亚群。pFast-E2 转化至含有穿梭杆粒的DHl0Bac 感受态细胞，构建重组杆粒Bacmid-E2，经PCR 鉴定正确后转染SF9 细胞，96 h 后取病变细胞上清液，提取核酸后经PCR 鉴定，结果显示扩增得到约1 100 bp 的目的片段（图1），测序结果显示E2 基因序列正确。表明获得了携带E2 基因的重组杆状病毒将其命名为Rb-E2。

图1 重组杆状病毒的PCR 鉴定Fig.1 Amplification of E2 gene by PCR from recombinant baculovirus

2.2 重组杆状病毒的IFA 鉴定结果 将P5 代重组杆状病毒以10 倍倍比稀释后接种SF9 细胞，7 d 后进行IFA 鉴定。结果显示，感染病毒的细胞可观察到特异的绿色荧光，而阴性对照则未出现荧光（图2），表明获得了重组杆状病毒，且杆状病毒中的CSFV E2 基因能够在昆虫细胞中获得正确表达。根据Reed-Muench 方法计算重组杆状病毒滴度为107.8TCID50/mL。

图2 重组杆状病毒Rb-E2 的IFA 鉴定结果（×200）Fig.2 Identification of Rb-E2 in SF9 cell by IFA(×200)

2.3 重组杆状病毒的western blot 鉴定结果 将P5代Rb-E2 接种生长良好的High Five 悬浮细胞，收获的上清液经western blot 鉴定。结果显示，经杆状病毒感染60 h 的细胞即可出现大小为52 ku 的目的蛋白条带；接种杆状病毒后96 h，上清液中Bac-E2 含量最高（图3），经SDS-PAGE 电泳后采用灰光度值法测定蛋白浓度可达50 μg/mL，表明获得了能够表达CSFV E2 蛋白的重组杆状病毒Rb-E2，表达的Bac-E2主要存在于细胞上清液中，且具有良好的反应原性。

图3 重组杆状病毒E2 蛋白表达的western blot 鉴定结果Fig.3 Identification of the recombinant E2 protein by western blot in Rb-E2

2.4 Bac-E2 的免疫效力评价

2.4.1 各组猪中和抗体的测定结果 将重组蛋白Bac-E2 乳化后免疫猪，同时设阳性对照组和阴性对照组，首免后每周测定各组猪血清的中和抗体。结果显示，免疫前各组猪中和抗体效价均小于1∶4（以1∶4 统计），Bac-E2 组首免后2 周，5 头猪中3 头猪的中和抗体效价不低于1∶32，首免后3 周，5 头猪血清中和抗体效价均不低于1∶64，首免后5 周（加强免疫后2 周）该组猪中和抗体效价均不低于1∶1 024；HCLV 组猪首免后3 周中和抗体效价介于1∶11～1∶22，首免后5 周（加强免疫后2 周）中和抗体效价提高至1∶64～1∶128。采用t 检验比较了两个免疫组的抗体水平，首免后5 周两组猪中和抗体效价差异极显著（p＜0.01）；阴性对照组猪血清中和抗体效价始终小于1∶4（图4）。表明Bac-E2 能够诱导猪产生高水平的猪瘟中和抗体。

图4 各组猪血清中和抗体效价的测定结果Fig.4 The titers of neutralizing antibody against CSFV in immuned pigs

2.4.2 攻毒试验结果 首免后35 d 经CSFV 石门强毒攻击后，在16 d 的观察期内，Bac-E2 组、HCLV组猪的体温正常、无发病、无死亡，保护率为100%；阴性对照组猪呈高热稽留、畏寒怕冷，食欲不振最终废绝，便秘与腹泻交替发生，并伴有体表出血、结膜炎等典型猪瘟临床症状，在攻毒后12 d内全部发病死亡（图5），剖检可见扁桃体溃疡、脾脏边缘梗死、淋巴结切面呈大理石样花纹，肾脏表面有大量出血点，呈现典型“雀斑肾”病理变化。

各组猪攻毒后的拭子中CSFV 的排毒检测结果显示，Bac-E2组、HCLV组猪攻毒后0～16 d的咽拭子及肛拭子中均未检测到CSFV 核酸。对照组猪攻毒后第4 d即可在其咽拭子中检出CSFV 核酸，平均为2.31×103拷贝/μL，肛拭子中病毒核酸为3.25×103拷贝/μL，此后拭子中病毒核酸拷贝数逐渐升高，至攻毒后第12 d 时咽拭子中病毒核酸可达1.038×104拷贝/μL；肛拭子中病毒核酸可达1.15×104拷贝/μL（表2）。以上结果表明，Bac-E2 能够有效抵御CSFV 石门强毒的攻击，与HCLV 组免疫效力相当，可以作为猪瘟E2 亚单位疫苗的候选抗原蛋白。

图5 攻毒后各组猪的存活情况Fig.5 Survival curve of pigs at 0-16 days post challenge with CSFV Shimen strain

表2 攻毒后各组猪咽拭子、肛拭子排毒量检测结果（平均拷贝数/μL）Table 2 Viral loads of challenged swine in pharyngeal and anal swabs(Mean copies/μL)

3 讨 论

疫苗接种是控制猪瘟的重要手段，其包括灭活疫苗、亚单位疫苗和弱毒疫苗。我国长期坚持采用全面接种猪瘟兔化弱毒疫苗来防控猪瘟，但目前猪瘟在我国依然存在，而且流行株由基因1 群演变为基因2 群，流行特点也从以往的频发大面积流行转变为无规律区域性的散发，隐性持续性感染病例增多，大部分猪场不得不加强疫苗免疫剂量及次数、采用超前免疫的方式防控猪瘟。此外，猪瘟弱毒疫苗在制造时易受BVDV、支原体、圆环病毒等血清外源病原污染，而且在临床使用过程中受母源抗体干扰较大，无法克服免疫耐受、区分野毒感染与疫苗免疫等问题，阻碍了中国猪瘟的净化，因此市场上亟待能够更有效防控并净化猪瘟的疫苗产品。 昆虫细胞-杆状病毒表达系统可高效表达外源基因，并可对外源蛋白进行转录后糖基化、磷酸化等加工过程，最终获得与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，显著优于细菌、酵母表达体系[12]。季新成等将CSFV E2 基因克隆到杆状病毒中，经SDS-PAGE、western blot 等方法证明该基因在昆虫细胞中正确表达，能够与猪瘟阳性血清发生特异性反应，但表达量较低[13]。本研究所选的E2 基因去除了跨膜区，保留了信号肽序列，获得了在上清中正确表达的重组E2 蛋白，表达量显著提高。胡刚叶等构建了两株含HCLV E2 基因的重组杆状病毒，并在蚕蛹血淋巴中获得了重组E2 蛋白，但制备工艺不适合工业化放大生产，而且未见免疫原性研究报道[14]。本研究利用悬浮培养的High Five 昆虫细胞接种重组杆状病毒进行E2 蛋白表达，生产工艺易于放大，适合工业化生产。 孙元等用腺病毒表达了重组E2 蛋白，免疫家兔和猪后均能产生猪瘟特异性抗体，并进行了靶动物的攻毒试验，攻毒后rAdV-E2 免疫猪抗体迅速升高，除了一头猪短期体温升高外，未出现任何其它临床症状[15]。本研究制备获得的Bac-E2 蛋白免疫猪后，在攻毒前其中和抗体已不低于1∶1 024，利用CSFV 石门强毒攻毒后5 头猪体温均未升高，未见异常临床症状，表明Bac-E2 蛋白的免疫原性较好。

高莹以CSFV 石门强毒的E2 基因为基础构建了3 种重组杆状病毒，可诱导仔猪产生高水平中和抗体，但未见其对基因2 群病毒的交叉保护性研究的报道[16]。本研究根据昆虫细胞密码子偏嗜性、简并性对E2 基因序列进行优化，使其与CSFV 基因1、2群病毒的E2 基因编码的氨基酸同源性最高，以提高E2 蛋白对不同亚群病毒株的交叉保护性。本实验结果表明，BAC-E2 免疫动物后可以诱导猪产生高水平的猪瘟特异性中和抗体，能够有效抵御CSFV 石门强毒的攻击，后期将采用CSFV 基因2 群流行株进行免疫攻毒试验，确定该蛋白对CSFV 2.1b、2.1c、2.1d 等亚群的广谱保护力。本研究制备的Bac-E2 可以作为猪瘟E2 亚单位疫苗的候选抗原蛋白，为猪瘟E2 亚单位疫苗的研制提供了实验依据。为了稳定并进一步提升Bac-E2 蛋白产量，后期拟对重组杆状病毒进行连续传代稳定性测试，同时建立生物反应器全悬浮培养昆虫细胞的生产工艺，促进该产品向大生产转化。