表面展示副结核分枝杆菌抗原MAP3007 的大肠杆菌活载体疫苗株的构建与免疫效力评价

许 秋，周 薇，丁仕豪，张 卓，陆 瑶，刘思国，于申业

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

副结核病（Paratuberculosis）是由禽分枝杆菌副结核 亚 种（Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis，MAP）引起的以反刍动物为主的肠道慢性消耗性疾病，主要导致肉芽肿性肠炎、持续性腹泻、逐渐消瘦和死亡[1-2]。副结核分枝杆菌宿主范围非常广泛，特别是奶牛、绵羊，给养殖产业造成严重的经济损失[3-4]。此外，副结核分枝杆菌与人类的克罗恩病之间也存在一定的联系，表明这种病原体也可能是一个重要的公共安全问题[5-6]。

副结核病目前世界范围内尚无经济有效的治疗药物，因此研发高效的疫苗显得尤为重要。细菌表面展示平台在疫苗研制方面有较为广泛的应用，其在疫苗设计方面具有独特的优势，它将抗原递呈在细菌表面，这样使呈现在细菌表面的多肽抗原更容易被免疫系统识别。此外，展示细菌大肠杆菌的脂多糖和外膜蛋白均具有较强免疫原性，可以作为所展示的外源蛋白的天然免疫佐剂，并且对疫苗生产条件要求低，易于大规模生产，方便运输，在新型疫苗的研制方面具有广阔的应用前景。因此，本研究借助INP 锚定序列将副结核分支杆菌蛋白MAP3007 展示至大肠杆菌表面，利用所构建的表面活载体疫苗免疫小鼠，检测小鼠细胞免疫和体液免疫，以期为新型副结核病疫苗的研制奠定基石。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 E.coli DH5α、BL21（DE3）感受态细胞、细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq DNA Polymerase 购自TaKaRa 公司；Nde Ι、Hind Ⅲ限制性内切酶购自Thermo Scientific 公司；多肽MAP3007cpep 由博仕生物公司合成；APC、PE 标记的CD4+和CD8+T 细胞抗体均购自Southern Biotech 公司；MILLIPLEX Mouse Th17 Magnetic Bead Kit 为Millipore 公司产品；小鼠脾脏组织淋巴细胞分离液试剂盒购自TBD 公司；副结核分枝杆菌K-10 标准株由本实验室保存，pET-INP表达载体由本实验室前期构建。6 周龄～8 周龄雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华公司。

1.2 重组质粒的构建与目的蛋白的表达 根据GenBank 中副结核分枝杆菌K-10 株基因组序列（NC_002944），设计特异性引物F：5'-TTTCCATGGTGAC TGGCGAGTCGGGCTCC-3'/R：5'-TTTAAGCTTGGAGC CCTCGTAGGTGTC-3'，以提取的副结核分枝杆菌K-10 基因组为模板扩增目的基因map3007，连接至pET-INP 载体，经PCR 鉴定后构建的重组质粒命名pET-INP-MAP3007。 按常规方法将pET-INPMAP3007重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，37 ℃培养至OD600nm=0.6 时加终浓度1 mmol/L IPTG 继续诱导培养4 h 后离心收集菌体，超声破碎后3 000 r/min 4 ℃离心5 min，分离上清和沉淀，采用SDS-PAGE检测后转膜，以抗6×His 抗体（1∶10 000）为一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）为二抗，经western blot 检测目的蛋白表达情况。同时设pET-INP 空载体转化为对照。

1.3 目的蛋白的定位分析

1.3.1 目的蛋白的亚细胞定位 取适量1.2 中诱导后收集的菌体，0.1 mol/L PMSF 重悬，超声裂解后3 000 r/min 4 ℃离心5 min，收集上清，沉淀用TE 缓冲液重悬，然后27 000 r/min 4 ℃离心1 h，收集上清，用10 mmol/L 的碳酸氢铵重悬沉淀，即为细胞壁成分；将两次收集的上清100 000 r/min 4 ℃离心4 h后，上清部分即为胞浆成分；此时用10 mmol/L 的碳酸氢铵重悬的沉淀，即为细胞膜成分。分别采用SDS-PAGE 检测后转膜，以抗6×His 抗体（1∶10 000）为一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）为二抗，经western blot 检测目的蛋白在细胞膜、细胞浆、细胞壁中的表达情况。

1.3.2 检测表面蛋白INP-MAP3007 的蛋白酶消化实验 取适量1.2 中诱导后收集的菌体，PBS 重悬后以500 μL/管分装至3个EP管中，分别标记为1，2，3号样品。将1 号样品始终置于冰上，在2 号样品中加入20 μL 25 mmol/L 的CaCl2和2.5 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K，3号样品只加20 μL 25 mmol/L的CaCl2，均37 ℃放置20 min，取出2 与3 号样品各加入6 μL 200 mmol/L的EDTA。将1、2 及3 号样品10 000 r/min 离心2 min，弃上清，沉淀用冰浴的PBS 重悬后，以抗6×His 抗体（1∶10 000）为一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）为二抗，分别经western blot 检测目的蛋白在细菌外膜的表达情况。

1.3.3 表面蛋白INP-MAP3007 的流式检测 将37 ℃过夜培养的重组菌INP-MAP3007 和INP-28a 分别转接5mL LB，当菌液培养至OD600nm=0.6 时加入IPTG 诱导培养4 h。然后取1mL 离心PBS 重悬后稀释菌液到OD600nm=0.8，用4%组织细胞固定液室温固定30 min，加入适量含1%BSA 的PBS 稀释带PE 标记的6×His 抗体，冰上孵育1 h，PBS 洗涤并重悬，加入带滤网的流式细胞管后，利用流式细胞仪检测目的蛋白在细菌表面是否表达。

1.4 小鼠免疫及攻毒试验 选取6 周龄～8 周龄的Balb/C 雌性小鼠110 只随 机 分为4 组：PBS 组30 只，INP-28a 对照组30 只，INP-MAP3007 重组菌免疫组30 只，空白未攻毒组20 只（仅用于增重试验和病理组织学试验）。其中INP-28a 与INP-MAP3007 组以5×105cfu/200 μL/只分别免疫INP-28a 空菌与INPMAP3007 重组疫苗，PBS 组注射等体积PBS，对小鼠进行3 次免疫，每次免疫间隔为两周，然后以副结核分枝杆菌K-10 标准株进行腹腔注射攻毒，剂量为5×108cfu/200 μL/只，空白对照组不做处理。整个实验期以初次免疫开始计算时间，二次免疫在第2 周，三次免疫在第4 周，攻毒在第6 周。

1.5 小鼠血清IgG 抗体的检测 分别于首免后第

2、4、6 周采集各组小鼠血液，分离血清，通过间接ELISA方法[7]测定每组小鼠特异性抗体IgG的水平。

1.6 小鼠细胞因子IL-10、IFN-γ和IL-4 检测 将初次免疫后第2 周，4 周（二免后2 周），6 周（三免后2 周），8 周（攻毒后2 周），14 周（攻毒后8 周）采集的各组小鼠血清样品，利用MILLIPLEX 细胞因子检测试剂盒检测各组小鼠的IL-10、INF-γ、IL-4 细胞因子水平。

1.7 小鼠CD4+、CD8+T细胞数量及百分比的测定分别于初次免疫后第2、4、6 周，每组随机迫杀3只小鼠，无菌摘取脾脏，分离脾淋巴细胞，采用1640 细胞培养液培养细胞，通过计数调整细胞浓度，加入12 孔细胞培养板中，细胞以MAP3007cpep多肽37 ℃刺激24 h，收集培养细胞，PBS 洗涤3次，分别加入APC 标记的羊抗小鼠CD4+抗体和PE标记的羊抗小鼠CD8+抗体，室温避光孵育30 min，PBS 洗涤3 次，流式细胞仪检测各组小鼠CD4+和CD8+T 细胞数量并计算二者的比值。

1.8 攻毒后小鼠增重率的变化 于初次免疫后第6周（攻毒时）、10 周（攻毒后4 周）、14 周（攻毒后8 周）对各组小鼠称重，通过小鼠体质量变化计算小鼠增重率变化，观察攻毒后对各组小鼠体重的影响。

1.9 攻毒后小鼠组织病理变化的检测 于初次免疫后第8 周（攻毒后2 周）、第10 周（攻毒后4 周）、第12 周（攻毒后6 周），每组随机处死3 只小鼠，无菌摘取小鼠的脾脏、肝脏和结肠，放入福尔马林中固定，制作病理切片，观察各组小鼠组织病理变化。

2 结 果

2.1 重组质粒的构建与目的蛋白的表达 利用载体通用引物对构建的pET-INP-MAP3007 重组质粒进行PCR 鉴定，结果显示，重组质粒目的条带大小与预期大小一致，进一步经测序比对确认正确构建了重组质粒pET-INP-MAP3007。将其转入BL21（DE3）感受态细胞中获得重组菌INP-MAP3007，IPTG 诱导表达后经western blot 检测，结果显示在52 ku 处有特异性条带，与预期INP-MAP3007 蛋白大小一致，且主要在沉淀中表达（图1A）。以上结果初步表明获得了副结核分支杆菌蛋白MAP3007 展示大肠杆菌。

2.2 目的蛋白的定位分析 通过亚细胞组份分离得到INP-MAP3007 重组菌的细胞膜、细胞浆、细胞壁成分，western blot 检测结果显示，INP-MAP3007蛋白存在于细胞膜和细胞浆组分中（图1B）。将蛋白酶K 消化后的样品进行western blot 分析，结果显示，经蛋白酶K 消化后的样品中INP-MAP3007 蛋白条带消失，而无蛋白酶K 消化的样品均存在特异性的蛋白条带，且蛋白大小与预期结果相一致（图1C）。将重组菌INP-28a、INP-MAP3007 用PE 标记的6×His 抗体孵育后经流式细胞仪检测，结果显示，INP-MAP3007 的荧光信号增强，而对照组INP-28a 无特异性的荧光信号（图1D）。以上结果表明已将外源蛋白INP-MAP3007 展示在BL21 的表面。

图1 MAP3007 蛋白的表达及定位分析Fig.1 Expression and localization analysis of INP-MAP3007 protein

2.3 小鼠血清IgG抗体的检测结果 采用间接ELISA方法检测免疫后各组小鼠抗体水平，结果显示，初次免疫后2周时INP-MAP3007重组菌免疫组产生少量抗体，与PBS、INP-28a 对照组相比，差异不显著（NS）。第二次免疫后2 周，重组疫苗组抗体水平明显高于PBS、INP-28a 对照组，差异极显著（p＜0.001），第三次免疫后2 周，抗体水平达到最高，与对照组差异极显著（p＜0.001）（图2）。表明INP-MAP3007 重组疫苗组能诱导小鼠产生较高的抗体水平。

图2 小鼠血清特异性IgG 抗体检测Fig.2 Detection of the specific IgG antibody in sera

2.4 小鼠细胞因子IL-10、IFN-γ和IL-4 的检测结果 采集各实验组小鼠首免后各时间点血清，利用MILLIPLEX 细胞因子检测试剂盒检测各细胞因子的表达水平。结果显示，INP-MAP3007 重组菌免疫组在初次免疫后2 周与4 周（二免后2 周）时，与PBS、INP-28a 对照组相比抗炎性细胞因子IL-10 相对水平较高，差异极显著（p＜0.001）；在第8 周（攻毒后2周），INP-MAP3007 重组疫苗组IL-10 急剧较少，但与PBS、INP-28a 对照组相比差异不显著（NS）；在第14 周（攻毒后8 周），INP-MAP3007 重组疫苗组IL-10 的产生明显低于PBS、INP-28a 对照组，与对照 组 相 比 差 异 显 著（p＜0.001）。在 免 疫 周 期 内INP-MAP3007 重组疫苗组IFN-γ的水平均较低，与对照组相比差异不显著（NS）；攻毒后INP-MAP3007重组疫苗组与对照组相比，IFN-γ相对水平较高，差异极显著（p＜0.001）；INP-MAP3007 重组疫苗组IL-4 在4 周（二免后2 周）和6 周（三免后2 周）相对水平较高，与对照组相比差异显著（p＜0.001），在攻毒后INP-MAP3007 重组疫苗组IL-4 水平降低， 但与PBS、INP-28a 对照组无差异（NS）（图3）。表明，INP-MAP3007 疫苗组能激活细胞免疫，刺激小鼠机体产生大量细胞因子。

2.5 小鼠CD4+T、CD8+T细胞亚群数量及百分比的测定结果 利用流式细胞术分析各组小鼠脾脏淋巴CD4+T、CD8+T细胞进行，结果显示，与对照组相比，INP-MAP3007 疫苗组的CD4+T、CD8+T 细胞均 显 著 增 加（p＜0.001）；INP-MAP3007 疫 苗 组 的CD4+T/CD8+T 细胞比率均显著高于对照组（p＜0.001）（图4）。表明，INP-MAP3007 疫苗组能诱导小鼠体内T 淋巴细胞增殖分化。

图3 小鼠血清中细胞因子检测Fig.3 Detection of cytokines in sera

图4 小鼠CD4+T、CD8+T 细胞数量及二者比值的测定结果Fig.4 Detection of the number and the ratio of CD4+T and CD8+T cells in mice

2.6 攻毒后小鼠增重率的变化 对攻毒后不同时间的小鼠进行体重称量，结果显示，在第6 周（攻毒时）至第10 周（攻毒后4 周）时，INP-MAP3007 疫苗组和对照组小鼠体重均处于增长状态，与空白未攻毒组小鼠增长基本一致，从图5 中看出PBS、INP-28a 对照组增长缓慢，其它两组增加较快；在第10 周（攻毒后4 周）至第14 周（攻毒后8 周）时，PBS、INP-28a 对照组小鼠体重减轻，但INP-MAP3007 疫苗组与空白未攻毒组生长速度基本一致。表明INP-MAP3007 展示疫苗可以显著降低副结核分枝杆菌对小鼠生长的影响，攻毒后不会引起小鼠体重消瘦。2.7 病理组织学变化 分别对攻毒后不同时间小鼠的结肠、肝脏和脾脏进行病理组织切片观察。结肠病理结果显示，在初次免疫后8 周、10 周、12 周时，INP-28a 对照组均出现不同程度的黏膜层广泛性坏死，可见杆状细菌样颗粒，固有层可见少量嗜中性粒细胞浸润，而INP-MAP3007 展示疫苗组与空白未攻毒组均未出现显著病变（图6A）。

图5 攻毒后小鼠增重率变化Fig.5 Changes in weight gain rate of mice after challenge

肝脏的病理结果显示，在初次免疫后8 周、10周、12 周时，INP-28a 对照组均出现实质内多发性微型肉芽肿；而INP-MAP3007 展示疫苗组出现轻微病变，实质内可见微型肉芽肿；空白未攻毒组无显著病变（图6B）。

脾脏的病理结果显示，在初次免疫后8 周时，INP-28a 对照组中红髓可见嗜中性粒细胞浸润；INP-MAP3007 展示疫苗组与空白未攻毒组均未出现显著病变。在初次免疫后10 周时，INP-28a 对照组中红髓可见微型肉芽肿伴嗜中性粒细胞浸润；INP-MAP3007 展示疫苗组中出现微型肉芽肿；空白未攻毒组无显著病变。在初次免疫后12 周时，INP-28a 载体对照组中红髓可见坏死细胞及少量嗜中性粒细胞浸润；INP-MAP3007 展示疫苗组中可见微型肉芽肿；空白未攻毒组无显著病变（图6C）。

图6 攻毒后各组小鼠结肠、肝脏、脾脏病理变化Fig.6 The pathological changes of colon,liver and spleen in mice of each group after challenge

以上PBS 组各组织的病理变化与INP-28a 对照组基本一致，故PBS 组病理图片未展示。综合上述结果表明，INP-MAP3007 展示疫苗对小鼠有一定的免疫保护作用。

3 讨 论

一些国家将疫苗免疫作为有效防控副结核病的措施。目前副结核疫苗主要分为灭活苗和弱毒疫苗，常用的主要有羊副结核疫苗Gudair®[8]、Silirum灭活疫苗和Neoparasec 弱毒疫苗[9]，然而弱毒疫苗并不能对牛群提供完全的保护效果，部分个体会因接种弱毒苗而感染副结核分枝杆菌[10]，可能会干扰临床诊断，对牛结核的皮试检测存在交叉反应。有研究表明，副结核灭活苗免疫的群体与未使用灭活苗免疫的群体相比发病率并无显著降低，所以目前该类疫苗仍然只能在限定范围内使用。因此研究开发具有良好保护力和有效性的疫苗对牛副结核病的防控与根除具有重要的意义[11]。

细菌表面展示系统可以将多种异源抗原表达展示于细菌外膜，并且其展示系统多种多样，操作简单，可以满足不同的需求，在活载体疫苗研究方面有较广泛的应用[12]。因此，本研究将编码强免疫原性蛋白的MAP3007 基因亚克隆到前期构建的pET-INP 展示载体，IPTG 诱导后在大肠杆菌BL21（DE3）中大量表达。进而通过蛋白酶K 消化实验和流式细胞术检测，证实该抗原成功展示在大肠杆菌外膜，获得了表面展示活载体疫苗INP-MAP3007。

INP-MAP3007 能够刺激小鼠产生高水平的细胞免疫和体液免疫。细胞免疫对于清除分枝杆菌等胞内菌感染具有重要作用[13]。T 细胞受抗原刺激后分化为Th1、Th2、Treg 等效应细胞，分泌产生IFN-γ、IL-4、IL-10 及其它细胞因子，其中IFN-γ和IL-4 分别是评价Th1 型免疫反应和Th2 型免疫反应的常用指标。副结核感染过程中存在早期感染阶段的Th1 优势反应向亚临床和临床阶段的Th2 优势反应的转换现象[14]。本研究中感染小鼠也存在这种趋势，INP-28a 对照组的IFN-γ水平在感染后第8 周至第14 周先升后降。疫苗组的IFN-γ水平在攻毒后有明显的升高，且显著高于对照组（p＜0.001），说明在同样的感染时间内INP-MAP3007 展示疫苗仍能维持高水平的Th1 型细胞免疫反应。Tc、NK、γδT、巨噬细胞活化后同样可以分泌IFN-γ[15-16]，INPMAP3007 免疫组IFN-γ的高水平表达也可能与上述细胞的分泌有关，具体机制还需要进一步研究。此外，INP-MAP3007 免疫组诱导产生的CD4+T 和CD8+T 细胞均显著高于对照组（p＜0.001），表明其能够诱导机体CD4+T、CD8+T 细胞增殖活化，CD4+T细胞亚群包含对分枝杆菌感染有抵抗作用的Th1、Th2 和Treg 效应细胞。IL-10 是一种有效的抗炎性细胞因子，IL-10 在副结核分支杆菌的感染中发挥着重要作用，可能成为一种重要的诊断指标[17]，IL-10通过抑制促炎细胞因子的分泌，增强了巨噬细胞内副结核分支杆菌的生长和持续存活，因此IL-10 分泌的降低对抑制副结核分支杆菌有重要意义[17]。本研究发现INP-MAP3007 免疫组攻毒后IL-10 明显降低，尤其在初次免疫后第14 周时，与PBS 组相比IL-10 显著降低，在攻毒后期IL-10 分泌减少可以更有效的抵抗副结核分支杆菌的感染。越来越多的研究表明，B 细胞在抗分枝杆菌感染中发挥着重要作用，本研究3 次免疫后，INP-MAP3007 免疫组较之PBS、INP-28a 对照组能产生更高水平IgG 抗体，说明INP-MAP3007 能够刺激B 细胞活化分泌抗体。此外，B 淋巴细胞能够与细胞免疫反应相互作用帮助机体抵抗细胞内病原体（包括分枝杆菌）[18]，同时，B 细胞可作为抗原递呈细胞活化T 细胞，进一步影响细胞因子的产生，对抵抗分枝杆菌的长期感染具有重要作用[19]。

持续腹泻与消瘦是副结核病的重要临床特征，经过对小鼠体重测定发现INP-MAP3007 免疫组体重变化趋势与空白未攻毒组相一致，并未引起小鼠消瘦。病理组织学观察发现INP-28a，PBS 对照组可见不同程度的细胞坏死和多发性微型肉芽肿；INPMAP3007 免疫组仅在肝脏中出现轻微的肉芽肿，肠与脾脏未出现明显病变，说明INP-MAP3007 展示活菌疫苗对小鼠有一定的免疫保护作用。

综上所述，本研究构建的INP-MAP3007 重组菌可诱导小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫反应，且维持小鼠增重，降低病理损伤程度，减缓病程，因此，其有望作为抵抗副结核的候选疫苗。本研究为副结核疫苗的研发提供新思路。