CDKN2B-AS1基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究

郝 娜， 贾亚静， 田芸婕， 路晓琳

(1.河北省邯郸市中心医院妇科， 河北 邯 郸 056001 2.河北医科大学第四医院妇科， 河北 石家庄 050010)

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)常发于育龄妇女，发病率为10%-15%，其在不孕者中发病率高达25%～40%，且呈逐年上升趋势，严重影响女性生活质量及生育功能[1]。但其发病机制尚不清楚，相关研究认为，EM是一种雌激素依赖性疾病，且其易感性有一定遗传性和家族聚集倾向[2]。基因单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)是常用遗传学标记，临床可用于分析复杂基因遗传特性[3]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B-反义RNA基因(cyclin-dependent kinase inhibitor 2B antisense RNA1，CDKN2B-AS1)位于9p21.3染色体，研究证实其rs4977574位点与冠心病、动脉粥样硬化性疾病等有关，其rs10965235位点与EM可能有关，但目前关于CDKN2B-AS1多态性与EM关系报道尚少[4]。因此，本研究拟探究CDKN2B-AS1 rs4977574位点、rs10965235位点与中国北方女性EM易感性的关系，以期为EM发病遗传机制深入研究提供一定参考依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:选择2017年12月至2019年7月邯郸市中心医院和河北医科大学第四医院收治的子宫内膜异位(EM)患者112例为病例组，年龄22～45岁，平均年龄(33.16±6.13)岁，月经周期28～32d，平均(30.19±1.36)d，平均身体质量指数(Body Mass Index，BMI)为(24.69±1.97)Kg/m2。根据美国生殖医学协会制定的(r-AFS)分期标准[5]，EM患者Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期73例。另取同期因宫外孕、输卵管黏连等手术患者112例为对照组，年龄22～45岁，平均年龄(33.74±5.91)岁，月经周期28～32d，平均(29.94±1.23)d，平均BMI为(24.32±1.68)Kg/m2，两组受试者年龄、BMI、月经周期比较差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。本研究经过邯郸市中心医院伦理委员会批准通过，收集受试者所有临床资料，所有样品采集及资料调查均取得患者及其家属知情同意并签字确认，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2纳入与排除标准:纳入标准：①均符合EM相关诊断标准；②患者均无亲缘关系；③均为22～45岁间适育龄女性。排除标准：①术前3个月有激素或其他药物治疗史；②有子宫、卵巢手术史或遗传病史者；③合并严重心、肝、肺或其他重要脏器功能障碍者；④合并恶性肿瘤者；⑤合并先天性子宫畸形或放置宫内节育器者。

1.3方 法

1.3.1标本采集:采集所有受试者清晨空腹静脉血5mL，于-80℃冰箱保存待检。

1.3.2PCR扩增及应基因型检测:采用DNA提取试剂盒(货号：158422，英国QIAGEN)提取受试者血液DNA，CDKN2B-AS1 rs4977574上游引物序列(5′→3′)：GGG TTA TGG GAA ATG CCA TG，下游引物序列(5′→3′)：TTG CTG AAG GGA CTC AAT GAG AG；CDKN2B-AS1 rs10965235上游引物序列(5′→3′)：CGT ACG CGG TTC TCT GAC CCG GTC CCT CGG C，下游引物序列(5′→3′)：CAT CCA GCG AGC AGT GCA GCC AGC ATT CCT GG；引物由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反应体系(25 L)：混池DNA 1.0 L，2×Primer STAR GC Buffer 12.5 L，dNTP 2.0 L，Primer STAR HS DNA Polymerase 0.25 L，ddH2O 9.25 L。反应条件：95℃ 5 min；98℃ 15s；64℃ 1 min；72℃，30s，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物纯化回收(DNA纯化回收试剂盒货号：DP214-3，北京天根生化科技有限公司)后送上海生工生物科技有限公司测序。采用Chroms 1.62 软件读取测序峰图。

2 结 果

2.1两组受试者一般资料比较:与对照组相比，病例组年龄稍小、BMI稍高、月经周期稍长，但两组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 两组受试者一般资料比较

2.2两组受试者CDKN2B-AS1等位基因及基因型频率比较:对照组与病例组患者CDKN2B-AS1基因rs4977574、rs10965235位点基因型和等位基因频率分布均符合哈代-温伯格遗传平衡定律，具有群体代表性。病例组与对照组CDKN2B-AS1 基因rs4977574位点等位基因A与G、AA与AG+GG基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，病例组CDKN2B-AS1基因rs10965235位点等位基因C、CC基因型频率高，等位基因A、CA+AA基因型频率低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组受试者CDKN2B-AS1等位基因及基因型频率比较n(%)

组别例数CACDKN2B-AS1 rs10965235CC CA+ AA对照组112168(75.00)56(25.00)61(54.46)51(45.54)病例组112187(83.48)37(16.52)77(68.75)35(31.25)χ24.3974.075P0.0360.044

表3 CDKN2B-AS1基因rs10965235位点多态性与EM临床分期的关系n(%)

2.3CDKN2B-AS1基因rs10965235位点多态性与EM临床分期的关系:与Ⅰ～Ⅱ期比较，Ⅲ～Ⅳ期EM患者CDKN2B-AS1基因rs10965235位点CC基因型频率高、CA+AA基因型频率低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4Logistic回归分析CDKN2B-AS1基因多态性与EM易感性的关系:CDKN2B-AS1基因rs4977574位点与AA基因型比较，AG+GG基因型与EM易感性无关(OR=1.105，95%CI：0.819-1.491；P=0.124)；CDKN2B-AS1基因rs10965235位点，与CC基因型比较，CA+AA基因型可降低EM易感性(OR=0.564，95%CI：0.347-0.917，P=0.000)，见表4。

表4 Logistic回归分析CDKN2B-AS1基因多态性对EM易感性的关系

3 讨 论

EM是指具有生物活性的子宫内膜组织出现在子宫腔以外其他部位，且存在增生、转移及高复发等恶性肿瘤性行为，临床主要表现为继发性痛经、慢性盆腔痛和不孕等，不仅影响患者生活治疗及生育功能，还给患者家庭及社会带来严重经济负担[6]。目前临床EM确诊率很低，CA125、CA19-9、TNF-α等指标可协助EM诊断，但特异性不强，预测EM疾病发生能力差，往往导致病情延误；另病理检测因其有创性导致患者接受度不一，临床应用受限。近来研究报道，全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)可筛查出有效疾病形状关联的SNP，可检测低频突变信息，且灵敏度和特性度高[7]。本研究以及因多态性为切入点研究CDKN2B-AS1基因多态性与EM的相关性可能为临床EM发病机制研究及诊疗提供一定参考。

多项研究证实EM受遗传因素影响。赖曾珍等[1]研究报道，Toll样受体4(TLR4)受体基因多态性与EM有关，且纯合子Asp299Gly基因型和Thr/Ile基因型可增加EM易感性，其检出率在EM Ⅲ～Ⅳ期中显著增加。Wang等[8]研究报道，白细胞介素-10(IL-10)基因多态性与EM易感性有关，IL-10 -819T/C位点和-592A/C位点等位基因或基因型频率高，且与EM患者临床分期有关。近来随着基因多态性的深入研究，基因多态性与EM易感性的关系备受关注。CDKN2B基因产物是一种肿瘤抑制因子，可调控细胞周期、延缓细胞增殖，CDKN2B-AS1基因为其反义RNA，基因全长126.3Kb，其表达水平升高亦与细胞增殖、黏附增加等有关[9]。乔林等[4]研究报道，CDKN2B-AS1基因rs4977574位点SNP与女性早发冠心病及高血红蛋白有关，其中GG、GA基因型携带者早发冠心病发生率显著增加。Kunnas等[10]研究报道，CDKN2B-AS1基因rs4977574位点GG基因型与冠心病风险增加有关，而可降低高血压易感性。Lee等[11]研究报道，CDKN2B-AS1基因rs10965235位点SNP与韩国女性EM易感性有关，其中携带CA、AA基因型EM易感性低，CC基因型携带者EM易感性高且EM临床分期亦高。本研究结果发现，与对照组比较，EM患者rs4977574位点等位基因A、G、GG、AG+AA基因型频率差异无统计学意义，且与EM易感性无关，可能因选择病例存在地域差异或疾病异质性，CDKN2B-AS1基因rs4977574与EM易感性无相关。本研究结果还发现，与对照组比较，病例组CDKN2B-AS1基因rs10965235位点等位基因C、CC基因型频率高，等位基因A、CA+AA基因型频率低，且与EM临床高分期及EM易感性有关，提示CDKN2B-AS1基因rs10965235位点SNP可能与EM易感性及疾病进展有关，CC基因型可增加EM易感性并与疾病分期高有关，A等位基因可能为保护基因，携带A等位基因可能降低EM易感率，但有文献报道，这种相关性也可能因rs10965235位点SNP与周围基因存在连锁不平衡而检测不到，而本研究并未关注rs10965235是否可能出现连锁不平衡、连锁互换等反应，因此后期仍需加大样本量进一步深入探究。

综上所述，CDKN2B-AS1基因rs4977574位点与EM易感性无关，rs10965235位点基因多态性与中国北方女性EM易感性及临床分期有关，CC基因型可增加EM易感性，携带A等位基因可能降低EM易感性。但由于本研究样本量少，选择样本范围小，另因地理差异导致结果存在局限性，后期应加大样本量、增加选择范围进一步深入探究。