大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

熊 文, 魏 文

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院， 湖北 恩施 445000 2.江汉大学医学院， 湖北 武汉 430056)

随着我国经济的快速发展及国民生活方式的深刻变化，我国心脑血管疾病的发病人数也持续增加[1]。虽然近年来血管介入技术在心脑血管疾病治疗中的普及挽救了大量患者的生命，但介入术后的血管再狭窄问题也一直影响着患者术后疗效[2]。众所周知，血管平滑肌细胞的过度增殖以及局部炎症反应的激活是导致血管再狭窄的重要原因。大蒜素是从大蒜中提取的活性成分，具有多种生物学活性。研究发现大蒜素可抑制多种肿瘤细胞的增殖，且发挥作用与其影响炎症反应密切相关[3]。同时大蒜素对血管平滑肌细胞钙电流具有一定的影响，但目前为止关于大蒜素对血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制研究却少有报道。因此，本研究通过体外培养VSMCs，并使用血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)刺激VSMCs增殖，观察了大蒜素对VSMCs增殖的作用以及对NF-κB信号通路介导的炎症反应的影响，从而为血管再狭窄治疗寻找潜在的药物。

1 材料与方法

1.1材料:SD雄性大鼠(120～150g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大蒜素购自美国Sigma生物公司；血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)购自美国R&D公司；DMEM/F12培养基及1×磷酸盐缓冲液均购自美国HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；CCK-8细胞毒性及增殖检测试剂盒(CCK-8)购自日本同仁化学研究所；BCA蛋白浓度检测试剂盒、脂多糖(LPS)、辣根过氧化物酶(HRP)抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)均购自上海碧云天生物公司；核转录因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65(P-p65)一抗均购自美国CST公司；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.2方 法

1.2.1大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离培养和鉴定:根据文献[4]中所述，获取并培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，用大鼠α-SM-actin抗体进行免疫荧光染色鉴定VSMCs。将细胞纯度达到95%以上的第3～5代血管平滑肌细胞用于后续实验。

1.2.2实验分组:将实验共分为4组：对照组(A组)、PDGF-BB刺激组(B组)、PDGF-BB+大蒜素处理组(C组)、PDGF-BB+大蒜素+脂多糖处理组(D组)。

1.2.3CCK-8实验:根据文献[5]中所述，步骤如下：①细胞活性检测：将血管平滑肌细胞从培养皿上消化下来后，以2.0×104个/孔接种在96孔板中。培养24h后待细胞生长融合至底壁80%时，将培养基更换为无血清培养基进行饥饿处理24h，然后再将细胞与含不同浓度(4,8,16,32,64和128μmoL/L)的大蒜素素或0.1%的DMSO的培养基共孵育24h，向每孔加入10μL CCK-8试剂继续培养2h后，在酶标仪上(450nm)测各孔的光密度(OD)值。②细胞增殖检测：将4组细胞按2.0×104个/孔接种于96孔板中，待血管平滑肌细胞融合至培养板底壁50%～60%，将培养基更换为无血清培养基饥饿处理24h后，然后向A组中加入含1%FBS的培养基，其余3组在加入1%FBS的基础上，分别向B组中加入PDF-BB刺激、向C组中加入PDGF-BB和大蒜素刺激、向D组中加入PDGF-BB和大蒜素及脂多糖刺激，24h后向每孔加入10uL CCK-8试剂继续培养2h后，在酶标仪上(450nm)测各孔的OD值。每组设6个复孔。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期:将细胞接种于6cm培养皿中，待细胞融合至60%左右时，饥饿处理24h。后将各组培养基更换为含PDGF-BB和/或相应浓度大蒜素及脂多糖的1% FBS的培养基，继续培养24h。接着用胰酶将细胞消化下来并在水平离心机中以1000转/min的转速离心，然后使用预冷的PBS将细胞洗涤2次后，在涡旋仪上边涡旋边加入预冷的70%的乙醇固定细胞，然后放置4℃过夜。取出细胞离心并用PBS洗涤细胞2次，然后加入0.4mL PI稀释液(含50mg/L的PI和100mg/L的RNase A)室温避光孵育30min，然后使用流式细胞仪(Becton Dickinson, USA)检测各组细胞周期分布情况，实验重复3次。计算S期分数和细胞增殖指数。S期分数(SPF)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。细胞增殖指数(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.5蛋白免疫印迹法(Western blot)检测蛋白表达:各组细胞按条件培养完成后，弃去培养上清液后，使用预冷的PBS清洗3遍，然后使用预冷细胞裂解液裂解细胞以获得蛋白，然后通过BCA蛋白浓度测定试剂盒根据说明书操作测定各组蛋白浓度，然后向各组蛋白中加入上样缓冲液煮沸后备用。然后将蛋白加入10%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。电泳完成后进行电转并进行封闭。然后根据指示条带将目的条带裁剪后分别与对应的一抗(NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、GAPDH)于4℃水平摇床中孵育18h以上。然后将不同分子蛋白条带取出后放入PBST中在水平摇床上洗涤3次，每次5min，然后将条带与HRP二抗室温孵育1～2h。取出条带放入PBST中在水平摇床上洗涤3次，每次5min，然后将蛋白面朝上放入化学发光成像系统，打开Image Lab成像系统(BIO-RAD，美国)拍取图像，通过软件测定各种目的蛋白条带灰度值及对应的内参GAPDH的灰度值，然后进行半定量分析。

1.2.6ELISA法测定培养上清液中TNF-α、IL-1β含量:各组细胞经PDGF-BB和/或大蒜素及脂多糖处理24h后，收集各组细胞培养液后离心去除细胞碎片，按照ELISA试剂盒说明书操作，计算出样品中对应的浓度。实验重复3次。

2 结 果

2.1大蒜素对VSMCs活性的影响:CCK-8结果(图1)显示，大蒜素浓度高于或等于64μmoL/L时，大蒜素可显著抑制VSMCs活性(P<0.05)；而当大蒜素浓度低于64μmoL/L后，大蒜素对VSMCs活性无明显影响(P>0.05)，故本实验选取的大蒜素浓度为32μmoL/L。

表1 各组血管平滑肌细胞S期分数和细胞增殖指数

注：与A组比较，*P<0.01；与B组比较，#P<0.01；与C组比较，&P<0.05；n=3

图1 大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞活性的影响

注：与DMSO组比较，**P<0.01；n=6

2.2大蒜素对VSMCs增殖的影响:CCK-8实验检测各组细胞增殖情况(图2)显示，与A组比较，B组VSMCs增殖活性增强1.25倍；与B组比较C组VSMCs增殖活性降低47.75%；而与C组比较，D组VSMCs增殖活性增强38.01%(P均<0.05)。

图2 大蒜素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

注：与A组比较，**P<0.01；与B组比较，##P<0.01；与C组比较，&&P<0.01；n=6

流式细胞周期检测结果如表1所示，与A组比较，B组细胞经PDGF-BB刺激后S期分数和细胞增殖指数分别升高1.37倍和0.98倍(P均<0.05)，提示PDGF-BB刺激后细胞周期进展加快，细胞增殖能力增强。然而与B组比较，C组加入大蒜素处理后，S期分数和细胞增殖指数分别降低44.1%和44.2%(P均<0.05)，表明细胞周期阻滞，细胞增殖能力减弱。而与C组比较，D组加入脂多糖刺激后，S期分数和细胞增殖指数分别升高56.7%和52.0%(P均<0.05)，细胞周期进展较C组加快，细胞增殖活性增强。

2.3大蒜素抑制VSMCs中P-p65表达:Western blot结果显示(图3)，与A组比较，B组磷酸化p65与总的p65比值(P-p65/p65)提高2.79倍(P<0.05)；而与B组比较，C组P-p65/p65显著降低近58.0%(P<0.05)。与C组比较，D组P-p65/p65增加64.8%(P<0.05)。另外，各组间总的NF-κB p65水平未见统计学差异(P>0.05)。

图3 大蒜素对血管平滑肌细胞内核转录因子κB p65的影响

注：与A组比较，**P<0.01；与B组比较，##P<0.01；与C组比较，&P<0.05；n=3

2.4大蒜素抑制VSMCs中TNF-α、IL-1β表达 ELISA结果(图4)显示，与A组比较，PDGF-BB刺激后培养上清液中TNF-α、IL-1β浓度分别增加1.80倍和2.75倍(P均<0.05)；而与B组比较，C组培养上清液中TNF-α、IL-1β浓度分别降低44.4%和45.8%(P均<0.05)。另外，与C组比较，D组培养上清液中TNF-α、IL-1β浓度分别增加28.1%和39.9%(P均<0.05)。以上结果提示，大蒜素可抑制PDGF-BB诱导的炎症相关因子的表达。

图4 大蒜素对血管平滑肌细胞炎症因子TNF-α、IL-1β表达的影响

注：与A组比较，**P<0.01；与B组比较，#P<0.05，##P<0.01；与C组比较，&P<0.05；n=3

3 讨 论

VSMCs过度增殖是引起血管再狭窄发生的重要原因之一。基于血管成形术以及支架植入术在内的介入操作及原发疾病引起的血管内膜损伤，可引起血液中白细胞、血小板及脂质颗粒等聚集并产生炎症反应；与此同时，聚集的血小板、炎症细胞等分泌细胞生长因子和炎症因子等介质，而这些介质可诱导VSMCs由静止的收缩型向活跃的合成型转变，从而引起血管内膜过度增殖并迁移至内膜，最终导致血管狭窄的发生。由此可见，对血管内膜过度增殖及炎症反应进行干预，可有效减少血管再狭窄的发生。

大蒜素是大蒜的主要活性物质，具有抗氧化，抗肿瘤及防治心肌纤维化等多种功效。在阿霉素诱导的大鼠心脏毒性模型中，大蒜素可抑制NF-κB蛋白表达或核转位，并降低大鼠血清中炎症因子(包括IL-1β和TNF-α)水平显示出抗炎作用[6]。研究表明，包括IL-1β和TNF-α等在内的炎症因子对VSMCs增殖具有促进作用；抑制NF-κB信号通路激活，可通过降低下游炎症因子的表达而对血管平滑肌细胞增殖起到抑制作用，从而减少血管损伤后新生内膜的形成[7]。最新研究也显示，LPS作为NF-κB信号通路的一种激活剂，它可通过诱导NF-κB信号通路的激活对血管平滑肌细胞增殖和迁移起到促进作用[8]。与之前研究相似，本研究中发现大蒜素可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖。进一步机制研究发现大蒜素可明显抑制VSMCs内NF-κB p65蛋白的磷酸化，以及降低了NF-κB信号通路下游的包括TNF-α、IL-1β在内的炎症因子的水平；而加用NF-κB信号通路激活剂LPS刺激后，可削弱大蒜素抑制VSMCs增殖的能力，同时NF-κB p65蛋白的磷酸化水平、IL-1β、TNF-α浓度均有所上升。

PDGF-BB是一种重要的促有丝分裂因子，可以通过激活细胞内多种信号通路促进细胞分裂增殖。有研究显示，PDGF-BB在血管损伤后的新生血管内膜增生中具有促进作用，其可诱导VSMCs增殖并向内膜迁移[9]。因此，PDGF-BB常被用来作为细胞增殖模型的诱导剂使用。我们的数据也显示，体外培养的VMSCs经PDGF-BB刺激后，其增殖能力显著增强。LPS可作为NF-κB信号通路的激活剂，其可通过增强NF-κB信号通路的激活，增强炎症因子表达，本实验显示其可削弱大蒜素抑制VSMCs增殖的能力，这为进一步确定大蒜素发挥作用的机制与其抑制NF-κB信号通路之间的关系提供了可靠的依据。

总之，我们的实验结果表明，大蒜素可显著抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞的增殖，而发挥作用的机制与抑制NF-κB信号通路激活及减弱炎症反应有关。