冠心病患者术前血清超氧化物歧化酶和微小RNA-29b表达及与冠脉CTA钙化积分相关性研究

孙时淼，张 涛

1.锦州医科大学附属第一医院(锦州 121000)；2.辽宁省辽阳市第二人民医院( 辽阳 111000)

冠心病好发于中老年人，冠状动脉粥样硬化是发病的重要原因[1]。病因学显示病变形成的血管可有不同程度阻塞，部分供血区心肌细胞伴有变性和坏死的形态改变[2]。研究显示粥样斑块的形成与机体的氧化应激改变有关[3]。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是重要的氧化应激指标[4]。近年研究显示微小RNA对氧化应激及粥样斑块的形成有明确调控作用[5]。根据冠心病的相关文献报道，选择表达有明显差异的微小RNA-29(miR-29b)进行研究。本实验检测冠心病患者术前血清中SOD和miR-29的表达，关注其与冠脉CTA钙化积分(Coronary CTA calcification score,CACS)的关系，分析其临床意义。

资料与方法

1 一般资料 选择2017年2月至2018年12月在我院确诊为冠心病的患者87例作为观察组。病例纳入标准：①患者有明显的劳累或休息时心前区疼痛的症状，经冠状动脉造影确诊；②首次确诊。排除标准：①合并心律失常、心瓣膜病等；②风湿免疫性疾病；③恶性肿瘤。其中男45例，女42例，年龄46～85岁，中位年龄59岁。均留取术前血清标本。选择经体检证实健康成人血清标本87例作为对照组。其中男44例，女43例，年龄42～68岁，中位年龄56岁。研究经医院伦理委员会批准，患者或家属签署知情同意书。

2 研究方法

2.1 样本量估计：应用两样本均数比较的评估方法：即n1=n2=2[(uα+uβ)/δ/σ]2+1/4uα2。以SOD表达为基础数据，并查阅文献，设定σ=0.6，δ/σ=0.3，α取双侧0.05，计算n1=n2≈87例。

2.2 SOD的检测：患者均基于空腹静脉血进行检测，应用2500 r/min 离心20 min后分离血清，应用羟胺氧化法检测SOD的表达。严格按说明书操作，做好质控。

2.3 miR-29b和的检测：在miR Base数据库中获得相关miR-29b和的成熟序列，并设计引物。miR-29b引物上游：5’-GGACTTCCCGACTGTTCCA-3’，下游：5’-CAGGTTCCAAAGTCTGCACTTG-3’。引物上游：5’-GCATAACTTCCAGGGACTCA-3’，下游：5’-CAGGATCTCATCTGTTGG-3’。U6上游：5’-GCTACATATACTACGAAAA -3’，下游：5’-CGCTTCATTTGCGTGAATCA-3’。应用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测。提取血清中总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模版进行PCR扩增。记录Ct值，通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

2.4 CACS的评定方法：冠脉造影确诊前均应用西门子SOMATOM Definition双源CT机，将患者心率控制在90次/min，1次完成扫描。以Agaston法计算冠状动脉左主干、左前降支、左回旋支和右冠状动脉的钙化积分，并计算总的钙化积分值(CACS)。

3 统计学方法 应用SPSS 17.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较行t检验，多组间比较行方差分析，并应用Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组中SOD和miR-29b表达的比较 两组中SOD和miR-29b的表达差别有统计学意义，即观察组低表达。见表1(图1、2)。

表1 两组中SOD和miR-29b表达的比较

图1 miR-29b的表达(qPCR)

图2 两组中SOD和miR-29b表达的比较

2 观察组中SOD和miR-29b在不同病变程度中表达的比较 观察组不同病变程度患者血清中SOD和miR-29b的表达差异有统计学意义。见表2。

表2 观察组中SOD和miR-29b在不同病变程度中表达的比较

3 观察组中不同CACS患者SOD和miR-29b表达的比较 本组中有冠脉钙化79例，无冠脉钙化8例，依据钙化积分分为三个亚组，低冠脉钙化组(CACS 1～100分)15例，中冠脉钙化组(CACS 101～400)40例，高冠脉钙化组(CACS>400)21例。观察组中不同钙化积分患者SOD和miR-29b的表达差异有统计学意义。见表3。

4 观察组中CACS与血清中SOD和miR-29b的相关性分析 应用Spearman相关分析显示CACS与SOD(r=-0.58,P=0.032)、CACS与miR-29b(r=-0.59,P=0.013)具有负相关性。

表3 观察组中不同CACS患者SOD和miR-29b表达的比较

讨 论

钙化的存在是冠脉粥样硬化重要标志，研究认为CACS与冠脉粥样硬化的存在及病变严重程度直接相关[6]。部分患者冠心病的形成较为隐匿，尤其是在青年人、中年人，在出现心肌梗死时症状才比较典型，因此早期进行客观指标筛选较为重要。冠状动脉病变形成时会出现粥样斑块的钙化，这也是粥样斑块的继发病变。早期检测到冠脉的钙化是早期诊断的重要标志[7]。粥样斑块的形成与氧化应激有关，近年认为SOD和MDA是重要的指标[8]。微小RNA是近年关注的与粥样硬化形成有关的因子，正常细胞内可以广泛存在，不仅对染色体和遗传因素可进行调控，还对氧化应激相关因子具有调节作用。也有研究认为微小RNA对脂代谢有重要的调节作用[9]。MiRNA是长度为22bp的内源性非编码RNA，是重要的转录调节因子[10]。MiR-29b是近年认识的与脂代谢有关的因子，也是在基因库中筛查出来的可能与冠心病和粥样斑块形成有关的因子。有研究认为miR-29b参与脂肪肝的形成，通过靶向结合PRDM2调控上皮和间质中的巨噬细胞，引起脂质核心的形成[11]。

本结果显示冠心病患者术前血清中SOD和miR-29b低表达，提示SOD和miR-29b是伴随着冠心病形成的重要血清因子。SOD低表达时对自由基的清除功能减弱，引发脂质和巨噬细胞的聚集，这主要与SOD具有对抗氧自由基对细胞造成的损害有关。MiR-29b也具有抗脂质沉积的作用，可以通过下游多种因子发挥调节作用。结果显示SOD与病变的严重程度相关，提示SOD异常表达可以促进冠心病的形成和进展[12]。SOD的下降使机体中氧自由基的生成增多，引起血管内皮细胞局部的损伤加重，血小板易于积聚在血管内皮细胞的边缘，尤其是损伤的内皮细胞，巨噬细胞附壁后加速斑块的形成[13-14]。近年来学者关注小RNA与冠心病的关系，也发现一些与脂质形成有关的因子[15]。结果显示冠心病中miR-29b的表达与病变程度和不同CACS分组有关，提示血清中miR-29b与病变的进展直接关联。结果显示冠心病中SOD与CACS、miR-29b与CACS呈负相关性，提示血清中两种因子的表达对判断病情程度有一定辅助价值。实验筛查到的SOD和miR-29b与冠心病的关系，提示二者异常表达对病变的进展有重要意义。MiR-29b可能通过调节巨噬细胞的功能参与病变的形成，也有研究显示miR-29b对局部胆固醇结晶形成及局部的淋巴细胞聚集有一定的促进作用，对局部炎性微环境有调控作用[16]。本实验检测的是术前血清中SOD和miR-29b的表达特征，这可能对后续诊断及判断病情程度提供一定的参考，但是大样本及多中心性的研究有待进一步明确。本实验的结果也可能是临床筛查的参考备选因子。

总之，冠心病患者术前血清中氧化应激指标SOD、miR-29b均低表达，可能与其对内皮细胞的损伤有关。临床中检测相关指标可能在一定程度上反应病变严重程度，可以为临床预测病变的风险性及判断病变程度提供一定的帮助。