木聚糖酶和果胶酶对小麦-玉米-豆粕型日粮的体外酶解研究

马文锋,毛 培,刘芦鹏,王占彬,朱艳芝,张 邦,郭亮

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023；2.兰州大学 草地农业科技学院，甘肃 兰州 730000；3.天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384)

小麦中蛋白质和氨基酸的含量高于玉米30%以上，在配制饲粮时可以用小麦替代部分玉米[1]。然而，小麦含有大量的非淀粉多糖，如木聚糖、果胶糖、纤维素等，这些多糖主要呈网状结构，与水分子结合后提高了动物肠道食糜的粘度，进而抑制小肠对营养物质的消化利用率[1-2]。猪属于单胃动物，机体不能分泌相关酶，不能高效地利用这一类多糖物质[2]。研究表明，日粮中添加专一性强的酶制剂，可以减少非淀粉多糖对动物的抗营养作用[3-5]。

在含有小麦、豆粕、麸皮等饲粮中添加木聚糖酶和果胶酶，可以破坏植物细胞壁，同时将一部分木聚糖和果胶分解为小分子单糖，进而减少肠道的代谢负担[5-7]。在评估酶制剂的作用效果时，可以采用动物试验和体外酶解试验两种方法。由于动物试验的周期较长，生长试验结果易受动物日龄和品种的影响，可以优先进行体外试验的初步评估，进而提高饲用酶制剂的开发效率。也有研究表明，非淀粉多糖酶的作用效果与饲料原料的组成与比例存在一定的计量关系[5-7]。因此，可以通过体外酶解试验分别研究不同单一类型的非淀粉多糖酶对动物日粮的体外酶解效果，筛选到适宜的酶制剂再进行复合酶的效果评定。本试验主要通过体外酶解的方法，模拟猪的胃肠道消化环境，研究木聚糖酶和果胶酶对小麦-玉米-豆粕型日粮营养物质酶解效率的影响，为这两种酶的合理使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 酶制剂

试验所用木聚糖酶和果胶酶均为单酶，购自河南仰韶生化工程有限公司。酶活性为：木聚糖酶100 000 U/g、果胶酶30 000 U/g。

1.2 试验设计及日粮组成

本试验采用单因子试验设计，每个单酶分别设置5个浓度梯度，每个梯度分别设置5个重复，其中木聚糖酶的添加浓度分别为10、30、50、70、90 U/g，果胶酶的添加浓度分别为3、6、9、12、15 U/g。

试验日粮组成及营养成分见表1。利用粉碎机对混合后的饲料粉碎，至95%以上过60目筛网，置于包装袋内密封，备用。

表1 试验日粮组成和营养成分Table 1 Ingredient composition of the experimental diets

注：①日粮无额外添加微量元素、氨基酸及矿物质等；②消化能为计算值，其他均为实测值。

Note: ①The diet has no additional trace elements, amino acids and minerals; ②DE is calculated，others are measured.

1.3 主要试剂

缓冲溶液：0.1 mol/L HCL-54 mmol/L NaCL溶液(pH 2.0)，0.1 moL/L磷酸缓冲液(pH 7.0)，胰蛋白复合酶(Sigma，P7545)溶液(pH 6.8)。

1.4 体外酶解操作过程

准确称取1 g饲料样品，放入150 mL三角瓶中，加入20 mL HCL-NaCL缓冲液(0.1 mol/L，pH 2.0)和0.1 g的胃蛋白酶(Sigma，P7000)。在厌氧条件下，将三角瓶置于39 ℃恒温摇床内，70 r/min振荡6 h；取出三角瓶打开封口膜，准确加入20 mL磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)和2.5 mL胰蛋白复合酶溶液，在溶液pH为7.0时，置于39 ℃恒温摇床，70 r/min震荡24 h；取出三角瓶中透析袋，室温静置20 min，取上清液检测还原糖含量，酶解残渣烘干后检测干物质和粗蛋白含量。

还原糖生成量(mg/g)=(C×VT)/(m×VS) ×1000

其中:C.标准曲线所查糖量(mg)；VT.提取液的体积(mL)；m.样品的质量(g)；VS.测定时的溶液体积(mL)。

干物质酶解率(%)=(M0-M1)/M0×100

粗蛋白质酶解率(%)=(M0×CP0-M1×CP1)/(M0×CP0)×100

其中:M0.饲料样品干物质重量(g)；M1.未酶解残渣干物质重量(g)；CP0.饲料样品粗蛋白含量(%)；CP1.未酶解残渣粗蛋白含量(%)。

1.5 数据分析

采用SAS(2001)中GLM模型进行数据分析，通过线性(Linear)和二次(Quadratic)效应评估不同浓度木聚糖酶和果胶酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响，处理间显著性判定水平为P<0.05，数据平均值以LSMEANS表示。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响

添加木聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解率的影响见表2。由表2可知，试验日粮中添加木聚糖酶时，提高了试验日粮的还原糖生成量(线性和二次，P<0.05)和粗蛋白质酶解率(线性和二次，P<0.05)。当木聚糖酶添加量分别为50、70、90 U/g时，还原糖生成量显著高于对照组和其它低剂量添加组(P<0.05)。

表2 添加木聚糖酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解率的影响Table 2 The effects of xylanase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

注：同行数据肩标为相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Notes:In the same row, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lower-case letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same below.

根据体外酶解试验结果，建立还原糖生成量和粗蛋白质酶解率(Y，%)与木聚糖酶添加水平(X，U/g)的回归方程，回归方程及相关参数见表3和表4。由表3和表4可知，随着日粮中木聚糖酶添加比例的提高，粗蛋白质酶解率和还原糖生成量分别与木聚糖酶含量存在线性和二次关系，其中两个线性方程的相关系数较高。木聚糖酶的最佳添加量通过线性方程推导：以粗蛋白质酶解率为评价指标，方程为Y=86.82-0.11(49.45-x)，相关系数为0.97，推导得出的木聚糖酶最适添加量为49.4 U/g；以还原糖生成量为评价指标，方程为Y=45.54-0.247(66.31-x)，相关系数为0.93，推导得出的木聚糖酶最佳添加量为66.3 U/g。

表3 木聚糖酶添加水平与粗蛋白质酶解率的关系Table 3 The correlation between the additional level of xylanase with enzymolysis efficiency of crude protein

表4 木聚糖酶添加水平与还原糖生成量的关系Table 4 The correlation between the additional level of xylanase with reducing sugar production

2.2 果胶酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响

由表5可知，添加果胶酶对试验日粮干物质和粗蛋白酶解率无显著影响(P>0.05)；当果胶酶的添加量为12 U/g时，还原糖生成量显著高于对照组和果胶酶低剂量(3 U/g)添加组(P<0.05)。根据体外酶解试验结果，建立还原糖生成量(Y，%)与果胶酶添加水平(x，U/g)的回归方程(Y=-0.20x2+3.93x+28.79)(R2=0.91)。根据二次方程推导得出果胶酶最佳添加量为9.8 U/g。

表5 果胶酶对日粮还原糖生成量、干物质和粗蛋白酶解效率的影响Table 5 The effects of pectinase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

3 讨 论

评定酶制剂对饲料营养物质的作用效果主要采用体内法和体外酶解法。体内法可以较为准确地反映动物对饲料营养物质的吸收利用率，但因其试验周期较长，受到外界的影响较多，造成其试验结果的变异性较大[7-9]。近年来，酶制剂的体外评价方法逐渐被认可，由于体外酶解法受到的干扰因素较少，试验条件可控，试验结果的重复性较高，目前已被广泛用于饲用酶制剂的效应评价[7-9]。

目前，我国常见的饲粮类型为玉米-豆粕型。近年来，随着非淀粉多糖酶在养猪生产中的广泛应用，一定程度上减少了抗营养因子对动物生产带来的不良影响，也相应提高了日粮原料的营养物质消化率，为生猪日粮类型的复杂化提供了可能[12-13]。胡向东等[14]研究表明当日粮中含有40%的小麦含量时，添加木聚糖酶可以获得与玉米-豆粕组生长猪相近的生长性能。王利等[15]研究发现，当日粮的小麦含量达到60%时，补充适宜比例的木聚糖酶可以获得高于玉米-豆粕组生长猪的粗蛋白质和有机物消化率。然而也有一些研究认为，当小麦的添加量超过日粮配比的50%～60%后，补充木聚糖酶不能完全获得玉米-豆粕型日粮的营养物质利用率[14]。造成这一结果的原因，可能是由于木聚糖是小麦的主要抗营养因子之一，它主要存在于种皮中，是构成细胞壁的主要成分。木聚糖具有很强的吸水力，其主链相连接的β-1，4-糖苷键结构相对稳定，而单胃动物体内缺乏用于降解木聚糖的酶类。因此，当日粮中小麦数量较高时，需要在日粮中添加专一性的木聚糖酶来提高小麦型日粮的营养利用率。木聚糖酶作为木聚糖降解体系中最关键的多组分酶系，目前在饲料行业得到了广泛应用。因此，本次试验设定日粮的小麦含量为50%，将其作为小麦型日粮的模拟配方进行研究，发现添加木聚糖酶可以提高小麦型日粮的还原糖生成量和粗蛋白质酶解效率，同时与木聚糖酶的添加水平存在一定的剂量效应。本试验结果表明，在针对木聚糖酶的体外评价研究中，试验日粮的小麦含量的差异可能是影响木聚糖酶适宜添加量的主要因素[14-15]。

果胶是一种高分子多糖化合物，广泛存在于饼粕类蛋白质原料的初生壁，其在豆粕中含量较高[16]。另外，果胶与纤维素、半纤维素以及木质素相互交联，在植物组织细胞中发挥一定的粘合作用，可以将大分子营养物质包裹在植物细胞壁，阻碍动物对营养物质的消化吸收[16]。在饲粮中补充果胶酶，可以解离植物细胞壁并释放出淀粉、蛋白质和脂类等营养物质，提高动物的营养物质利用率[17]。目前，针对果胶酶的体外试验主要集中在研究果胶酶对不同单一原料底物的体外酶解作用，较少探讨果胶酶对全价日粮的酶解效果，因此本试验的营养底物主要模拟小麦型全价日粮的配方组成。由于日粮类型及原料含量的变化，关于果胶酶的不同体外酶解结果可能存在较大的差异。本次试验结果表明，添加果胶酶提高了小麦型日粮的还原糖生成量，但是对于日粮的粗蛋白质和干物质酶解效率无明显改善作用，相关原因尚需要进一步的研究。

4 结 论

木聚糖酶添加量为50、70、90 U/g时，还原糖生成量显著高于对照组和其它低剂量添加组；果胶酶添加量为12 U/g时，还原糖生成量显著高于对照组和3 U/g添加组；木聚糖酶添加浓度由10 U/g提高至90 U/g时，显著提高了小麦-玉米-豆粕型的还原糖生成量和粗蛋白质酶解率；果胶酶添加浓度由3 U/g提高至15 U/g时，显著提高了还原糖生成量。