赖氨酸-甘氨酸共聚物的合成与性能研究

张雨欣，江世智，李 涛，王基伟，2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.宁德师范学院闽东畲医药福建省高校工程研究中心，福建宁德 352100）

聚氨基酸作为以多肽链为主要结构的聚合物，是一类具有生物活性的重要物质。聚氨基酸类材料具有良好的稳定性、生物相容性和可降解性〔1〕。不同种类氨基酸可以用来合成共聚物，并在水溶液中可自组装形成纳米粒子，在药用载体、药物控制释放和组织工程等生物医药领域方面被广泛研究〔2〕。

聚氨基酸作为一种极具发展前景的生物材料，对其进行功能化修饰以更好地满足生物医药、生物科技领域的需求具有重要的意义〔3〕。氨基酸侧链上如果含有丰富的活性官能团如羧基、氨基，这些官能团为功能化聚氨基酸改性提供了有效位点，有利于扩展其应用〔4〕。目前聚氨基酸制备的常见问题是聚合物的长度易出现偏差，分子量分布相对较宽〔5〕，而生物医药等领域对聚氨基酸的分子量及粒径大小有特别要求〔6〕。因此，高效简便地合成粒径大小可控、粒径分布均匀，并使其具有丰富的可修饰的活性官能团的聚氨基酸具有很重要的理论意义和应用价值。本文以六甲基二硅氮烷（HMDS）为引发剂，采用α-氨基酸-N-羧基酸酐（NCA）开环聚合，通过控制反应条件制备了一系列含有活性氨基的赖氨酸-甘氨酸共聚物Poly（KmGn），并对其结构和相关性能进行了研究。本研究为简便可控地合成聚氨基酸及聚氨基酸在生物领域的应用提供一定的研究基础。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐（Lys（Z）-NCA）和甘氨酸-N-羧基环内酸酐（Gly-NCA），成都蒽莱生物科技有限公司；HMDS，上海麦克林生化科技有限公司；乙醚，国药集团化学试剂有限公司；溴化氢∕乙酸溶液（HBr∕CH3COOH，HBr 的质量分数为45%）和三氟乙酸（TFA），阿拉丁试剂有限公司；氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），阿拉丁试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）经氢化钙干燥过夜后，减压蒸馏备用。

核磁共振波谱仪（Bruker Advance III-400，德国Bruker 公司）；动态光散射仪（Zetasizer Nano ZS∕ZEN3690，英国Malvern 公司）；扫描电子显微镜（SEM，HitachiX650，日本日立公司）。

1.2 赖氨酸-甘氨酸共聚物Poly（K，G）的合成在氮气环境中，将752.0 mg（0.002 5 mol）的Lys（Z）-NCA溶于5 mL 无水DMF 中，加入0.017 3 mL（4.798 mmol∕mL）HMDS 引 发 聚 合，室 温 搅 拌3 d。再 将248.0 mg（0.002 5 mol）的Gly-NCA配成的DMF溶液加入上述反应瓶中（摩尔比为1：1）继续室温反应3 d。待反应结束后将上述溶液转移至500 mL 烧杯中，分3 次共加入150～200 mL 无水乙醚搅拌，观察到有白色固体析出，置于4 ℃冰箱使产物充分沉降，过滤乙醚溶液得到产物置于真空干燥箱，45 ℃条件下干燥过夜。得到分子长度为60 个氨基酸链段长度的共聚物Poly［K（Cbz）30G30］。改变Lys（Z）-NCA和Gly-NCA 的投料比，投料比（Lys（Z）-NCA 与Gly-NCA 的摩尔比）分别为1.5：1、2：1，用相同方法制备了其他2 种共聚物Poly［K（Cbz）36G24］和Poly［K（Cbz）40G20］。

将得到的573.9 mg Poly［K（Cbz）30G30］溶于5.0 mL TFA 中，缓 慢 加 入0.06 mL HBr∕CH3COOH 混 合 溶液，于25 ℃搅拌反应12 h后，在过量的乙醚中沉降、洗涤、过滤、干燥，将得到的固体溶解于无水乙醇，置于截留分子量为3 500的透析袋中，在蒸馏水中透析纯化得到白色固体Poly（K30G30）。采用相同的处理方法得到另外2种共聚物Poly（K36G24）和Poly（K40G20）。系列聚氨基酸共聚物的合成路线图见图1。

图1 聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）合成路线图

1.3 赖氨酸-甘氨酸共聚物纳米胶束的制备、粒径及形貌测试将所制备的聚氨基酸溶于PBS 缓冲溶液，进行超声分散，静置过夜，形成聚氨基酸纳米胶束。采用动态光散射（DLS）对制备的纳米胶束的粒径大小和分布进行测试。将聚氨基酸溶于乙醇，超声分散，将溶液放置在硅片上，使溶剂迅速挥发后用SEM进行测试观察。

2 结果与讨论

2.1 赖氨酸-甘氨酸共聚物Poly（K，G）的结构表征图2A、B分别给出了系列聚合物Poly［K（Cbz）mGn］和Poly（KmGn）的核磁共振氢谱（1H-NMR），均以DMSOd6为溶剂。图中x 峰和y 峰分别在3.5 和2.5 处，是DMSO-d6的溶剂峰。图2A 中在δ=7.33 处的g 峰代表聚赖氨酸侧链苄氧羰基保护中的苯环峰；δ=5.00处的f 峰表示与苯环直接相连的亚甲基峰；δ=2.96处的e 峰是聚赖氨酸侧链δ 位碳的质子峰；δ=1.64、δ=1.38、δ=1.25 处的b、d和c峰，是属于聚赖氨酸侧链中—（CH2）3—的质子区。a峰和h峰在4.23和3.76处，代表赖氨酸和甘氨酸残基的酰胺键，δ=4.23（br，1H，—COCH）与δ=3.76（br，1H，—COCH2）。以上2个峰的出现，说明2种α-氨基酸-NCA发生了开环聚合反应，成功制备出了系列聚合物Poly［K（Cbz）mGn］。同时根据两处酰胺键质子峰的积分面积比，可以计算出所制备的聚合物中2种组成单体的摩尔比与实际投料比非常接近，说明反应按照设计可控地进行。图2B中g 峰和f 峰基本消失，其他峰位略微偏移，说明聚赖氨酸侧链区域的N-δ-苄氧羰基的保护基已完全去除，已经形成了系列Poly（KmGn）聚合物。

图2 聚氨基酸共聚物Poly［K（Cbz）mGn］（A）和Poly（KmGn）（B）的核磁共振氢谱

2.2 赖氨酸-甘氨酸共聚物纳米胶束的表面形貌观察采用SEM 对所制备不同结构的聚氨基酸纳米胶束的表面微观形态结构进行观察研究。聚氨基酸共聚物Poly（K30G30）胶束的电镜图片见图3。由图3 可以观察到，所合成的聚氨基酸形成了粒径分布均匀的球型胶束。在水溶液中，所制备的共聚物中的聚甘氨酸链段由于其疏水性作用形成了纳米胶束的内核；共聚物中聚赖氨酸链段由于侧链上大量氨基的存在使其具有亲水性，且聚赖氨酸具有α-螺旋结构，成为亲水段并形成致密的外壳。因此，所制备的两嵌段聚氨基酸可以在一定条件下自组装形成具有稳定空间立体结构的两亲性纳米胶束。同时，聚氨基酸纳米胶束侧链氨基的存在，可以对聚氨基酸的侧链进行各种功能化修饰，以满足在生物技术及生物科技领域应用的需求。

2.3 赖氨酸-甘氨酸共聚物纳米胶束的粒径及分布研究通过DLS 测定了系列聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）的粒径及其分布。其中Poly（K30G30）粒径大小及分布见图4。从图4 可以看出，Poly（K30G30）所形成胶束的平均粒径大小为135.8 nm，且粒径分布均匀。说明通过严格控制反应条件，采用HMDS引发剂引发NCA的开环聚合可以很好地控制聚氨基酸的分子量及分布，使其具有合理的粒径大小及分布。合理的粒径的聚合物纳米胶束可以通过高渗透长滞留效应（EPR）被动靶向传输到肿瘤，实现化疗药物的有效运送，是其作为药物载体的基本前提。

图4 聚氨基酸共聚物Poly（K30G30）胶束的粒径及粒径分布

对一系列3种不同分子组成的聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）的粒径大小进行对比研究，以探讨结构对聚氨基酸胶束粒径的影响。不同聚合物粒径的具体结果见表1。从表1 可以看出含有疏水性聚甘

氨酸嵌段最多的聚合物的胶束粒径最大，而含有最少聚甘氨酸嵌段的聚合物胶束粒径最小。说明随着疏水段的增加，纳米胶束的粒径随之增大。这是由于聚合物在形成纳米胶束的过程中，疏水段聚甘氨酸嵌段作为胶束的内核，通常来说胶束的内核越大，胶束的粒径也越大。结果也表明，可以通过调整亲-疏链段在聚合物中的比例改变胶束粒径的大小。

表1 聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）单体组成及粒径

3 结论

通过NCA 开环聚合成功地制备了系列赖氨酸-甘氨酸共聚物，核磁共振氢谱证明所合成的聚合物结构符合分子设计。所合成的系列聚氨基酸共聚物可以在水中自组装形成粒径分布均匀的纳米胶束结构。对于相同聚合度的共聚物，胶束粒径大小与聚合物亲-疏水段的组成比例有关。所合成的聚氨基酸的侧链含有大量的氨基，便于进一步进行侧链修饰。系列聚氨基酸共聚物的合成与性能研究对聚氨酸类纳米粒子在生物技术及生物科技领域的应用具有一定的意义。