蒙药阿给水提物的抗炎作用及其机制研究

薛焱 刘欣媛 高洪波 薛永志

中圖分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）12-1425-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.04

摘 要 目的：研究蒙药阿给（即冷蒿地上部分）水提物对小鼠的抗炎作用，并初步探讨其作用机制。方法：取小鼠60只，随机分为模型对照组（水）、阿司匹林组（阳性对照，0.4 g/kg）和阿给水提物高、中、低剂量组（60.0、30.0、15.0 g/kg，以生药量计），每组12只。连续灌胃给药5 d后，采用2，4-二硝基氯苯诱导小鼠耳肿胀;另取小鼠60只，同法分组并给药后，采用角叉菜胶诱导小鼠足肿胀;计算小鼠耳肿胀度、肿胀抑制率以及足肿胀率，评价阿给水提物的抗炎作用。取小鼠角叉菜胶致炎足跖组织，分别采用酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和前列腺素E2（PGE2）的含量，采用硫代巴比妥酸微量法测定丙二醛（MDA）含量，采用硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）含量。结果：与模型对照组比较，阿司匹林组和阿给水提物高、中、低剂量组小鼠耳肿胀度均显著降低（P<0.05或P<0.01），肿胀抑制率分别为72.3%、71.1%、52.6%、36.8%;阿司匹林组和阿给水提物高、中剂量组小鼠在致炎后各时间点的足肿胀率以及阿给水提物低剂量组小鼠在致炎后0.5、4.0 h时的足肿胀率均显著降低（P<0.05或P<0.01）;阿司匹林组和阿给水提物高、中剂量组小鼠足跖炎性组织中TNF-α、IL-1β、PGE2、NO和MDA含量均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结论：蒙药阿给水提物对2，4-二硝基氯苯致耳肿胀、角叉菜胶致足肿胀模型小鼠均具有显著的抗炎作用，其机制可能与抑制TNF-α、IL-1β和PGE2生成，减少炎性组织中NO和MDA的过量释放有关。

关键词 蒙药阿给;冷蒿;水提物;抗炎作用;机制;小鼠

Study on Anti-inflammatory Effects and Its Mechanism of Water Extract from Inner Mongolia Medicine Agi

XUE Yan1，LIU Xinyuan2，GAO Hongbo2，XUE Yongzhi2（1. School of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China;2. College of Preclinical and Forensic Medicine，Baotou Medical College，Inner Mongolia Baotou 014040，China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory effects of water extract from Inner Mongolia medicine Agi （i. e. the aerial part of Artemisia frigida）， and to preliminarily explore its mechanism. METHODS： Totally 60 mice were  randomly divided into model control group （water）， aspirin group （positive control， 0.4 g/kg）， Agi water extract high-dose， medium-dose and low-dose groups （60.0， 30.0， 15.0 g/kg， by crude medicine）， with 12 mice in each group. After intragastric administration for consecutive 5 d， the ear swelling of mice was induced by 2， 4-dinitrochlorobenzene.  Another 60 mice were grouped and admini- stered by the same way， and the foot swelling of mice was induced by carrageenan. The ear swelling degree and inhibitory rate， paw swelling rate were calculated to evaluate the anti-inflammatory effect of Agi water extract. The contents of TNF-α， IL-1β and PGE2 in plantar inflammatory tissue induced by carrageenan in mice were determined by ELISA. The content of MDA was determined by thiobarbituric acid trace method and NO by nitrate reductase method. RESULTS： Compared with model control group， the degrees of ear swelling of mice were decreased significantly in aspirin group and Agi water extract high-dose， medium-dose， low-dose groups （P<0.05 or P<0.01）， and the inhibitory rates of ear swelling were 72.3%， 71.1%， 52.6%， 36.8%， respectively; the paw swelling rates of mice in aspirin group and Agi high-dose，medium-dose groups were decreased significantly， while those were decreased significantly in Agi water extract low-dose group 0.5 h and 4.0 h after inducing inflammation （P<0.05 or P<0.01）; the contents of TNF-α， IL-1β， PGE2， NO and MDA in plantar inflammatory tissue of mice in aspirin group and Agi water extract high-dose， medium-dose groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Inner Mongolia medicine Agi water extract has obvious anti-inflammatory effects on ear swelling induced by     2，4-dinitrochlorobenzene and paw swelling induced by carrageenan， and its mechanism may be related to the inhibition of TNF-α， IL-1β and PGE2 generation， the reduction of NO and MDA excessive release in inflammatory tissues.

KEYWORDS   Mongolia medicine Agi; Artemisia frigida; Water extract; Anti-inflammatory effect; Mechanism; Mice

蒙药阿给（蒙文名）为菊科蒿属多年生植物冷蒿（Artemisia frigida Willd.）的地上部分，味苦、涩，性凉、燥，临床上用于各种出血、关节肿胀、肾热、月经不调、疮疥等的治疗[1]。传统医学常以冷蒿全草入药，主要用于治疗黄疸型肝炎、胆囊炎、小便不利、皮肤瘙痒、湿疹、蛔虫病和蛲虫病等，可作为“茵陈”的代用品[2]。此外，该植物还有食用价值，牧民常取其嫩枝，用热水烫后和玉米面，蒸煮后食用，是一种营养价值较高的食物[3]。目前，对阿给的研究主要集中在药材质量标准[4]、化学成分[5-6]、含量测定[7]、有效成分积累规律[8]、炮制[9]和药理药效[10]等方面。已有文献记载，阿给有止血、消肿、消“奇哈”之功效[1]，但关于其抗炎作用及机制尚不清楚。本课题组前期通过预实验发现，阿给水提物表现出较好的抗炎活性。基于此，本研究采用2，4-二硝基氯苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠足肿胀等急性炎症模型，考察阿给水提取物的抗炎作用并探讨其作用机制，旨在为该药材的开发和临床应用提供一定的科学依据。

1 材料

1.1 仪器

NanoVue Plus型微量紫外-可见分光光度计（美国GE公司）;Epoch型酶标仪（美国BioTek公司）;GENIUS 6K-D型台式低速自动平衡离心机（长沙市鑫奥仪器仪表有限公司）;RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品与试剂

阿司匹林片（阳性对照，湖南新汇制药股份有限公司，批号：161009，规格：50 mg）;2，4-二硝基氯苯（上海瀚思化工有限公司，批号：20161113）;角叉菜胶（美国Sigma公司，批号：17H1148）;肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒、一氧化氮（NO）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150414、20150316）;大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA检测试剂盒、白细胞介素1β（IL-1β）ELISA检测试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号：2401142416、1151142416）;丙二醛（MDA）检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号：20170317）;其余试剂均为分析纯或实验室自制，水为蒸馏水。

植物全株采自内蒙古乌兰察布市四子王旗（地理位置：41 °52 ′39 ″N、111 °07 ′25 ″E，海拔：1 370 m），经内蒙古医科大学药学院薛焱教授鉴定为菊科蒿属植物冷蒿（A. frigida Willd.）。取其地上部分（即阿给），于室外自然晒干后，在室温下贮藏，备用。

1.3 动物

健康昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体质量为（18±2）g，由内蒙古大学实验动物研究中心提供，动物生产许可证号：SCXK（蒙）2016-0001。

2 方法

2.1 阿给水提物药液制备

取阿给适量，粉碎成粗粉。称取该粗粉10.0 g，置于砂锅中，加水煎煮2次，每次加水100 mL，每次煎煮1.0 h;趁热抽滤，并用水清洗滤渣及容器2～3次;合并滤液，减压旋转蒸发浓缩至浸膏状（得率为9.98%），并在4 ℃下密封保存。临用时，取提取物浸膏，以水制成药液进行动物实验。

2.2 阿给水提物对2，4-二硝基氯苯致小鼠耳肿胀的影响考察

参考文献方法[11]，取小鼠60只，随机分为模型对照组、阿司匹林组（0.4 g/kg，以水制成药液;剂量参照文献方法[11]设置）和阿给水提取物高、中、低剂量组[60.0、30.0、15.0 g/kg，以生药量计;剂量参照本课题组前期预实验结果设置），每组12只。各组小鼠按0.2 mL/10 g灌胃相应药物，模型对照组灌胃等容水，每天1次，连续5 d。于末次给药0.5 h后，于小鼠右耳内、外侧各均匀涂抹2%的2，4-二硝基氯苯乙醇溶液0.05 mL致炎，以左耳作为对照（涂抹生理盐水）。涂抹致炎药物1.0 h后，剪下小鼠左右耳廓，用8 mm打孔器在两耳相同部位处取下耳片并称定其质量，计算耳肿胀度和肿胀抑制率：耳肿胀度（mg）=致炎后右耳片质量-未致炎左耳片质量;肿胀抑制率（%）=[（模型对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/模型对照组平均肿胀度]×100%。

2.3 阿给水提物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响考察

参照文献方法[11]，另取小鼠60只，按“2.2”项下方法分组并给药，每天1次，连续5 d。末次给药前测量并记录各鼠右后足跖容积。末次给药30 min后，在各鼠右后足跖皮下注射0.1%角叉菜胶溶液（以生理盐水为溶剂，临用新配）0.1 mL致炎。在末次给药前和注射角叉菜致炎后0.5、1.0、2.0、4.0 h时分别测量并记录小鼠右后足跖容积，并计算致炎后各时间点小鼠的足肿胀率：足肿胀率（%）=（致炎后右后足跖容积-致炎前右后足跖容积）/致炎前右后足跖容积×100%。

2.4 阿给水提物对角叉菜胶致炎小鼠足跖炎性组织中TNF-α、IL-1β、PGE2含量的影響考察

在“2.3”项下对小鼠注射角叉菜胶致炎后4.0 h时（测定右后足跖容积后），脱颈处死各组小鼠。自其踝关节下剪下右后足跖，剥皮剪碎后放入装有冰生理盐水的试管中，匀浆处理，以3 000 r/min离心15 min，取上清液，于-70 ℃冰箱保存，备测。取上述上清液，室温解冻后，采用ELISA法以酶标仪测定TNF-α、IL-1β、PGE2含量，均严格按照相应试剂盒说明书操作。

2.5 阿给水提物对角叉菜胶致炎小鼠足跖炎性组织中MDA、NO含量的影响考察

取“2.4”项下小鼠足跖炎性组织标本上清液，室温解冻后，采用硫代巴比妥酸微量法测定MDA含量，采用硝酸还原酶法测定NO含量，均严格按照相应试剂盒说明书操作并以酶标仪测定。

2.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 阿给水提物对2，4-二硝基氯苯所致小鼠耳肿胀的影响

与模型对照组比较，阿司匹林组小鼠和阿给水提物高、中、低剂量物组小鼠耳廓肿胀度均显著降低（P<0.05或P<0.01），耳肿胀抑制率分别为72.3%、71.1%、52.6%、36.8%。其中，阿司匹林组和阿给水提物高剂量组小鼠右耳皮肤均无红肿充血现象;阿给水提物对2，4-二硝基氯苯致小鼠耳肿胀的抑制作用有随剂量增加而增强的趋势。各组小鼠耳肿胀度及肿胀抑制率的测定结果见表1。

3.2 阿给水提物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响

与模型对照组比较，阿司匹林组和阿给水提物高、中剂量组小鼠在角叉菜胶致炎后各时间点的足肿胀率以及阿给水提物低剂量组小鼠在致炎后0.5、4.0 h时的足肿胀率均显著降低（P<0.05或P<0.01）。其中，阿司匹林组和阿给水提物高剂量组小鼠足肿胀率较为接近;阿给水提物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的抑制作用有随剂量增加而增强的趋势。各组小鼠足肿胀率的测定结果见表2。

3.3 阿給水提物对角叉菜胶致炎小鼠足跖组织中TNF-α、IL-1β和PGE2含量的影响

与模型对照组比较，阿司匹林组和阿给水提物高、中剂量组小鼠足跖炎性组织中TNF-α、IL-1β和PGE2的含量均显著降低（P<0.05或P<0.01）;阿给水提物低剂量组小鼠足跖炎性组织中上述指标含量虽较模型对照组有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠足跖炎性组织中TNF-α、IL-1β和PGE2的含量测定结果见表3。

3.4 阿给水提物对角叉菜胶致炎小鼠足跖组织中MDA和NO含量的影响

与模型对照组比较，阿司匹林组和阿给水提物高、中剂量组小鼠足跖炎性组织中NO和MDA含量均显著降低（P<0.05或P<0.01）;阿给水提物低剂量组小鼠足跖炎性组织中上述指标含量虽较模型对照组有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。各组小鼠足跖炎性组织中NO、MDA的含量测定结果见表4。

4 讨论

抗炎药物是用于抑制组织损伤后所产生的炎症反应的药物，临床上抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物，应用广泛，常用的有甾体抗炎药和非甾体抗炎药（即解热镇痛药）两类，但长期应用会对机体产生较大的毒副作用[12]。蒙药因其资源丰富、副作用少的优点逐渐受到学者重视，其在抗炎方面的研究已经取得了较大的进展，如狼毒、草乌和蓝盆花等多种蒙药及其提取物均有较好的抗炎活性，广泛用于各种炎症疾病的治疗[13]。蒙药阿给具有消肿、消“奇哈”之功效[1]，其原植物冷蒿在内蒙古广泛分布，占我国冷蒿资源的87.30%[3]，药用资源储备丰富;而且其分布区多与蒙古族世代聚集区相互重叠，在民间积累了很多成功的临床用药经验[14]。为充分发挥蒙医药学的优势，本研究对阿给的抗炎作用及其机制进行了探索。

已有文献均未记载阿给的临床使用剂量，因此本研究按照前期预实验结果，以该药材水提物对小鼠的半数致死量（LD50）的1/10作为高剂量组，中、低剂量组则依次按50%递减;同时，以经典的解热镇痛抗炎药物阿司匹林为阳性对照，采用小鼠耳肿胀、足肿胀炎症模型考察阿给水提物的抗炎作用。结果显示，各剂量阿给水提物均可不同程度地降低小鼠的耳肿胀度和足肿胀率，表明其具有良好的抗炎作用。

中蒙药的抗炎机制较为复杂，主要作用途径包括影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPAA）系统功能，抑制花生四烯酸代谢，干扰炎症细胞、清除氧自由基和抗血栓生成等[15-17]，与现代药理学炎症机制研究结果相一致，故其临床抗炎活性的开发价值越来越受到学者的关注。TNF-α可介导炎症反应，也可诱导IL-1β、IL-6等炎症因子的产生，从而使局部炎症反应加重[18];IL-1β含量在炎症急性期炎性部位明显升高，可引起细胞或组织损伤，并能引起其余细胞因子表达，进一步加重损伤[19];PGE2是一种炎症介质，可引起血管扩张、通透性升高及白细胞渗出等炎症反应，抑制PGE2的合成可以减轻炎症反应[20]。本研究结果显示，高、中剂量阿给水提物可显著降低小鼠足跖炎性组织中TNF-α、IL-1β和PGE2的含量，提示其抗炎作用机制可能与抑制促炎因子TNF-α、IL-1β的产生，下调炎症介质PGE2的表达有关。

NO有双重作用，正常情况下内皮源性NO可抑制炎症反应的发生，但在炎症过程中会诱导一氧化氮合酶合成大量的NO，从而产生细胞毒作用，并加重炎症反应;同时，NO能促进TNF-α、IL-1β和PGE2等炎症因子/介质的合成和释放[21-22]。氧自由基通过参与脂质过氧化反应，产生的脂质过氧化物可被分解生成MDA，MDA可氧化细胞质膜，其含量可反映组织细胞结构的受损程度[23]。本研究结果显示，高、中剂量阿给水提物能够显著降低小鼠足跖炎性组织中NO和MDA的含量，提示抑制NO和炎症过程中脂质过氧化产物的生成可能是阿给水提物抗炎作用的机制之一。

综上所述，蒙药阿给水提物对2，4-二硝基氯苯致耳肿胀、角叉菜胶致足肿胀模型小鼠均具有显著的抗炎作用，其机制可能与抑制TNF-α、IL-1β和PGE2生成，减少炎性组织中NO和MDA的过量释放有关。后续研究拟更深入地探讨阿给的抗炎作用机制以及其药效物质基础，为开发蒙药新药、指导临床用药提供更多理论与实验基础。

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（收稿日期：2019-11-05 修回日期：2020-04-01）

（编辑：段思怡）