miRNA-548a-5p在预测特发性肺动脉高压患者血流动力学恶化的作用

吴粤 孙媛媛 王岚 赵勤华 宫素岗 袁平 刘锦铭

1同济大学附属上海市肺科医院检验科200433；2同济大学附属上海市肺科医院肺循环科200433

特发性肺动脉高压 (idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)是由多种因素引起肺小血管重构,肺循环阻力进行性增高,右心负荷增加进而导致右心衰竭致患者死亡的恶性心血管疾病[1]。确诊IPAH 的金标准是右心导管检查(right heart catheterization,RHC),其多项血流动力学指标如肺血管阻力 (pulmonary vascular resistance,PVR)是评价预后的重要因素[2]。近年来许多研究表明微小 RNA (microRNA,miRNA)在IPAH 疾病发生发展过程中起着重要作用[3]。有研究发现,miRNA-548 或其他亚型可以参与多种疾病的免疫反应[4-5],但miRNA-548a-5p在IPAH 的研究尚未见报道。本研究通过筛选出IPAH 患者和健康人群的血浆中差异表达的miRNA,观察其表达量和患者的血流动力学参数相关性,探讨血浆miRNA 是否可以作为预测患者血流动力学指标恶化的生物标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究回顾性地纳入了从2010年5月至2017年6 月入住上海市肺科医院的IPAH患者和健康对照人群各12例。纳入标准：所有患者均经RHC明确诊断。入选标准根据文献[6]：静息状态下,平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure,mPAP)≥25 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kpa),肺小动脉楔压 (pulmonary arterial wedge pressure,PAWP)≤15 mm Hg。排除标准：排除其他类型的肺动脉高压患者,如慢性血栓性肺动脉高压、左心疾病及呼吸系统疾病引起的肺动脉高压;排除合并有其他肺部疾病的患者;排除患有影响激素代谢的慢性或急性疾病的患者;排除正在使用或既往使用过激素药物及影响激素的药物的患者;排除神经精神疾病的患者。对照组人群是疑似IPAH 患者,经RHC 明确排除IPAH,且无其他慢性疾病的相对健康的人群。

该研究经上海市肺科医院伦理委员会批准(K19-069Y)。所有参与者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般临床资料 记录IPAH 患者和对照组人群的年龄、身高、体质量,并计算体质量指数(body mass index,BMI),比较2组基线资料的差异。同时收集患者的相关临床参数,包括：世界卫生组织心功能分级 (World Health Organization functional class,WHO-FC)、6 分钟步行距离、氨基末端脑利钠肽前体等。

1.2.2 主要检测参数 右心导管参数包括平均右心房压 (mean right atrial pressure,m RAP)、mPAP、PAWP、 心输出量 (cardiac output,CO)、 肺 血 管 阻 力 (pulmonary vascular resistance,PVR)等。

1.2.3 miRNA 提取及芯片检测 抽取每例患者外周抗凝血约4 ml,以3 000 r/min (离心半径10 cm)离心5 min分离得血浆标本。按照Trizol试剂说明书提取总RNA,并用miRNeasy提取试剂盒 (QIAGEN)提取miRNA。应用NanoDrop 1000检测RNA 纯度及质量。采用丹麦EXiqon公司生产的18.0版miRCURYTMLNA 芯片。芯片筛选2 组间差异表达的 miRNA 分子,并用Targetscan、Miranda和Pictar等靶基因软件预测其靶基因。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。符合正态分布的连续变量用±s 表示,组间比较采用独立样本t检验;分类变量采用构成比表示,组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关检验。采用线性回归及多重线性回归分析预测因子。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 2组间一般情况差异无统计学意义。患者的WHO-FC、6分钟步行距离及血流动力学参数m RAP、mPAP、PAWP、PVR、CO 等见表1。

2.2 miRNA 检测结果 IPAH 患者与对照组血浆中miRNA 芯片检测结果显示,满足Fold change≥2,且P ＜0.05条件的差异miRNA 有797个上调,有42个下调,其中miRNA-548a-5p表达差异最显著,因此选择miRNA-548a-5p 进行后续的研究。IPAH 组miRNA-548a-5p表达明显高于对照组(t=3.038,P ＜0.05);IPAH 组男性患者的miRNA-548a-5p表达水平高于对照组男性 (t=2.466,P ＜0.05);IPAH 组 女 性 患 者miRNA-548a-5p表达水平与对照组女性比较差异无统计学意义。见表1。

表1 2组患者的一般资料比较

2.3 miRNA-548a-5p表达与血流动力学参数的相关性 在IPAH 患者的miRNA-548a-5p表达量和血流动力学参数的相关性分析中,miRNA-548a-5p表达量分别与m RAP、m PAP、PAWP和PVR 呈轻到中度正相关 (r 值分别为0.477、0.616、0.607、0.517,P 值均＜0.05),但是与CO 及心指数未见显著相关性。见表2。

表2 IPAH 患者miRNA-548a-5p与血流动力学参数的相关性

2.4 miRNA-548a-5p对血流动力学恶化的预测情况 将miRNA-548a-5p 表达量作为自变量,和miRNA-548a-5p表达量相关的血流动力学mPAP、PVR 分别作为因变量,采用线性回归及逐步多重线性回归分析,结果发现在所有IPAH 患者中,校正了年龄、性别、体质量指数和WHO-FC 后,miRNA-548a-5p表达升高可作为mPAP、PVR 升高的独立预测因子。见表3、4。

表3 单因素线性回归分析miRNA-548a-5p预测血流动力学升高的情况

表4 多重线性回归分析miRNA-548a-5p预测血流动力学升高的情况

2.5 miRNA-548a-5p 的受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析结果 为更进一步探讨差异化表达miRNA-548a-5p的意义,本文采用了ROC 曲线分析方法测试了miRNA-548a-5p对IPAH 组和对照组的鉴别效能。结果得出,ROC 曲线下面积为0.799。通过最佳临界值分析得出,miRNA-548a-5p的敏感度为91.7%,特异度为66.7%。临界值为10.5 (表5)。血浆miRNA-548a-5p高表达组血流动力学相关参数m RAP、mPAP、PAWP 和PVR均高于miRNA-548a-5p 低表达组 (t 值分别为1.969、3.010、1.861、2.250,P 值均＜0.05)(表6)。

3 讨论

miRNA 作为近年来较为成熟的分子标志物,其表达会受到人体各种生理病理变化的影响。本研究证实,IPAH 患者血浆中miRNA-548a-5p 的表达显著升高,并首次证明其表达量还可以独立预测m PAP和PVR 的升高。

最近研究表明,患者血浆中多项miRNA 表达对肺动脉高压的诊断和预后分析都有很大的价值[7]。Kheyfets等[8]通过检测14例儿童肺动脉高压患者血浆中miRNA 表达的变化,之后通过PCR技术水平验证,找到了32个循环的miRNA 和肺血管功能相关参数有相关性,这些miRNA 是预测儿童肺动脉高压患者的血管功能标志物。也有学者证明miRNA-150水平是独立于年龄、6分钟步行距离、病程、红细胞分布宽度等多项指标的肺动脉高压预后标志物[9]。Jin等[10]发现在左心疾病相关肺动脉高压人群中,miRNA-206和肺动脉收缩压呈显著相关性,说明其可以预测此部分人群的疾病严重程度。Sarrion等[11]选取了12例患者和10名健康者进行对照,发现了61 个差异显著的miRNA,尤其是 miRNA-23a,作者不仅发现miRNA-23a和肺功能具有相关性,还通过沉默miRNA-23a发现促进了下游PGC1α的表达。

本 研 究 主 要 发 现,IPAH 患 者 中miRNA-548a-5p表达明显上调,这提示血浆中miRNA-548a-5p可能参与了患者的疾病进展,进而导致患者和健康人群血浆中miRNA-548a-5p表达差异显著。目前国内外关于miRNA-548a-5p在肺动脉高压患者中表达水平罕有报道,笔者只是观察到miRNA-548a-5p在IPAH 患者血浆中表达明显上调,其在肺组织和肺动脉平滑肌细胞中的表达以及对肺动脉高压疾病进展中的作用机制仍需后续深入实验加以明确。

影响IPAH 患者预后的因素很多,PVR 是反映IPAH 患者疾病严重程度的重要指标,受PAWP、mPAP及CO 的影响 [PVR= (m PAPPAWP)/CO][12],PVR 升高会限制右心室射血入肺动脉,从而影响肺血流的灌注和全身血液的供应。本研究的线性回归模型提示miRNA-548a-5p的表达量是预测PVR 和m PAP 升高的独立指标,ROC曲线分析表明,ROC 曲线下面积为0.799,通过最佳临界值分析得出,miRNA-548a-5p 的敏感度 为91.7%, 特 异 度 为66.7%, 说 明miRNA-548a-5p在诊断IPAH 可能具有较高的敏感性和特异性。

综上所述,本研究结果提示IPAH 患者较对照人群的miRNA-548a-5p表达显著升高,并显示miRNA-548a-5p是预测患者mPAP 和PVR 升高的独立预测因子,可以为临床诊断和判断IPAH患者疾病恶性程度提供参考。

表5 多重线性回归分析miRNA-548a-5p预测血流动力学升高的情况

表6 按照miRNA-548a-5p的临界值分组后2组血流动力学差异情况 (±s)

表6 按照miRNA-548a-5p的临界值分组后2组血流动力学差异情况 (±s)

注：1 mm Hg=0.133 k Pa

组别例数平均右心房压(mm Hg)平均肺动脉压(mm Hg)肺小动脉楔压(mm Hg)肺血管阻力(Wood units)心输出量(L/min)心指数(L·min-1·m-2)miR-548a-5P ＜10.5 8 1.6±1.1 15.9±9.9 5.3±1.8 2.6±2.4 6.6±2.5 3.9±1.5 miR-548a-5p≥10.5 16 5.3±5.1 52.3±33.1 8.0±3.9 10.6±9.1 5.2±1.9 3.2±1.2 t 值1.969 3.010 1.861 2.250-1.508-1.287 P 值0.018 0.001 0.048 0.016 0.146 0.212

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突