初治和复治肺结核病例中北京基因型结核分枝杆菌与抗结核药物耐药性的关联研究

于丹 付雷 姚丛 邢青 易俊莉 李传友 刘毅

1国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院 北京市儿科研究所微生物研究室100045；2首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 耐药结核病研究北京市重点实验室药物学研究室101149；3首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 耐药结核病研究北京市重点实验室细菌免疫室101149；4北京结核病控制研究所中心实验室100035

肺结核病 (tuberculosis,TB)主要是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染导致的威胁人类健康的重大传染病,是全球面临的重要公共卫生问题。根据WHO 最新结核病报告,2018年全球新发TB 病例约1 000万[1],我国也是全球23个TB高负担国家之一,TB的预防和控制面临较为严峻的挑战。其中对耐药结核病的控制更是其中的难题,其流行也给北京市的TB防治工作带来了新的挑战,但目前对北京地区耐药结核病的流行缺乏研究,尤其对北京基因型菌株的流行和耐药性产生之间的关系缺乏深入的研究。

M.tb有不同的基因型,不同基因型菌株对药物的耐受程度也有不同[2]。北京基因型M.tb在中国和东亚国家广泛流行[3-5],通常认为其流行与耐药性产生和治疗失败有关[6-7]。有研究表明北京基因型M.tb对异烟肼 (isoniazide,INH)、利福平(rifampicin,RIF)、链霉素 (streptomycin,SM)和乙胺丁醇 (ethambutol,EMB)的耐药率要明显高于非北京基因型M.tb[8],北京基因型M.tb对氧氟沙星的耐药率也显著高于非北京基因型M.tb[9],但也有研究表明菌株的流行与抗结核药物耐药性产生无相关性[9-11]。不同地区的研究会得出不同的结论,这可能和选取的研究对象以及研究分组有很大关系。TB 在临床治疗中一般可分为初治(新发)TB 和复治TB,有研究显示初治和复治TB中耐药菌株的比例有很大差别[12-13],流行和传播的基因型也有不同。国内外已有许多对北京基因型M.tb与抗结核药物耐药性的报道且结论众多,但未按照初治和复治TB进行分别研究,未对初治和复治病例中北京基因型菌株的流行和抗结核药物的耐药性产生进行关联分析。

鉴于此,笔者收集了北京市一个年度的菌阳M.tb分离菌株,按照初治和复治进行了分组,进行了基因型流行与抗结核药物耐药性产生间的关联分析研究,探讨了初治和复治病例中北京基因型M.tb流行与抗结核药物耐药性出现间的相关性。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 M.tb临床分离株来源于北京各地区所分离的1 140例确诊TB 病例的涂阳标本,其中包括1 049例初治 (新发)结核病、91例复治结核病病例。按照TB 诊断标准WS288-2017版,初治病例主要包括： (1)从未进行过抗结核药物治疗;(2)正在进行标准抗结核化疗而用药未满1个月。复治TB病例主要包括：(1)初治失败、完成规定的治疗疗程后确认治愈,痰涂片又出现阳性;(2)疾病预防控制机构确诊的病例治疗≥1个月、中断治疗≥2个月后再次到疾病预防控制机构接受治疗;(3)新涂阳病例治疗第5个月末或疗程结束时,涂片检查阳性;(4)复治涂阳病例治疗第5个月末或疗程结束时,涂片检查阳性;(5)新涂阳病例治疗第2、3个月末涂片检查阳性的病例; (6)其他,如治疗≥1个月的涂阴病例,再次涂片出现阳性等。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.2 药物敏感性试验 以H37Rv株为对照菌株,采用WHO 推荐的比例法[14]。含药培养基中药物浓度分别为INH 0.2 mg/L、RIF 40 mg/L、EMB 2 mg/L、SM 4 mg/L、左氧氟沙星(levofloxacin,LFX)2 mg/L、阿米卡星 (amikacin,AK)30 mg/L、对氨基水杨酸 (para-aminosalicylic,PAS)2 mg/L 和卷曲霉素 (capreomycin,CPM)40 mg/L,当菌株与对照菌株相比生长速度超过1%时,即认为对药物耐药。对任意一种药物耐药称为耐此药菌株,至少对INH 和RIF同时耐药称为耐多药菌株。

1.3 基因分型 采用标准的间隔区寡核苷酸分型操作方法[15]对分离的菌株进行分子分型鉴定,根据直接重复位点识别TB 菌株的基因型。结果与SpolDB4数据库 (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/)进行比较[16]。

1.4 统计学分析 使用SPSS 22.0软件,数据使用例或率表示,采用χ2检验或Fisher精确概率检验比较各组统计结果。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的人口学特征和风险因素 本研究收集的TB 病例一般资料见表1,其中82.5%(941/1 140)为北京基因型菌株,17.5% (199/1 140)为非北京基因型菌株。结果显示,男性和流动人群更易感染北京基因型M.tb (χ2值分别为5.098、3.896,P 值均＜0.05);年龄≥65岁年龄段的人更易感染非北京基因型M.tb (χ2=5.315,P ＜0.05);北京基因型菌株在初治和复治患者之间的差异无统计学意义。

2.2 初治病例中北京基因型菌株的耐药情况 在初治病例中,北京基因型M.tb 对INH、AK、CPM 和PAS的耐药率分别低于非北京基因型菌株(χ2值分别为2.670、15.282、16.219、22.676,P值均＜0.05)。见表2。

2.3 复治病例中北京基因型菌株的耐药情况 在复治病例中,北京基因型M.tb对AK 和PAS的耐药性均低于非北京基因型 (χ2值分别为15.167、4.574,P 值均＜0.05)。而非北京基因型M.tb的耐药率要高于北京基因型。并且非北京基因型中耐多药结核病菌株的比率也显著高于北京基因型(χ2=7.046,P ＜0.05)。见表3。

在初治和复治病例中北京基因型菌株的流行和抗结核药物出现耐药性的相关性并不相同,在复治病例中北京基因型菌株出现耐药性的比例高于初治病例,北京基因型菌株的流行只在复治病例中显示了与耐多药结核病菌株的产生具有相关性。

3 讨论

北京基因型M.tb仍是在中国[17]乃至全球广泛流行的基因型,目前对菌株的流行和抗结核药物耐药性产生间的相关性研究一直缺少定论,原因可能有很多方面,但未从初治和复治TB的角度来分析这个问题。本研究正是从初治和复治的角度来分析北京基因型菌株的流行和耐药性产生的相关性,为正确认识北京地区M.tb的流行和抗结核药物耐药性产生间的相关性提供了新的视角和依据。

本研究发现在该地区主要流行的M.tb为北京基因型菌株,在TB病例中男性人数多于女性,男性更易感染北京基因型M.tb,这与以往研究的结果一致[10,18];同时发现流动人群更易感染北京基因型菌株,这可能和流动人群的居住地人口密度较高、环境拥挤等因素使北京基因型更容易在这些地区传播有关。除了性别和流动人口(无北京户籍或居住时间＜5年)因素,本研究还观察到年龄≥65岁人群感染非北京基因型的风险性更大,至于为何年龄较大的人群容易感染非北京基因型菌株,还需要更大规模的深入研究。

表1 结核病病例人口学特征 [例 (%)]

表2 初治病例菌株与抗结核药物耐药性的关系 [例 (%)]

表3 复治病例菌株与抗结核药物耐药性的关系 [例 (%)]

国内外对北京基因型M.tb流行与耐药性产生的相关性研究的数据虽有报道但还不够深入,笔者按初治和复治TB病例分别进一步分析其与抗结核药耐药产生间的相关性。数据表明初治和复治结核组各有几种抗结核药物的耐药性的产生与北京基因型M.tb的流行有关,这与前期的研究结果一致[13]。在重庆的一项研究表明北京基因型菌株的流行和复治TB耐药性的产生具有相关性[12]。在长治地区研究表明PAS、丙硫异烟胺、LFX 和AK 等4种二线抗结核药物中LFX 耐药率 (13.0%)最高,初治病例的单耐药率明显高于复治病例,有无治疗史对TB病例耐药率的影响差异有统计学意义[19]。但在我国南方地区开展的一项研究表明北京基因型菌株的流行和抗结核药物的抗性间缺少关联[5],产生不同的结果也可能受地域的影响,在不同地区北京基因型分布存在差异,对北京基因型与耐药间的相关性还需进一步的研究。

本研究结果表明初治和复治病例中北京基因型与非北京基因型M.tb对抗结核药物的耐药率有着明显的差异,北京基因型M.tb的流行和抗结核药物耐药性的出现有不同的相关性。在初治病例中和INH、AK、CPM 和PAS 耐药性的出现有关联,北京基因型M.tb对INH、AK、CPM 和PAS的耐药率均低于非北京基因型;而在复治病例中只在AK 和PAS耐药性的产生上有关联,北京基因型菌株对AK 和PAS的耐药率低于非北京基因型菌株,且在复治病例中北京基因型菌株中出现耐多药结核病的概率更低,非北京基因型菌株中更易出现耐多药结核病。说明在2组病例中菌株的流行和药物产生耐受的相关性并不相同,这也表明对TB的预防控制应考虑将初治和复治患者分开进行,未来需要开展深入的研究。

综上所述,北京基因型菌株的流行和抗结核药物的耐药性产生间的关联十分复杂,各种因素都可能会影响研究的结果,需要更进一步深入的研究。本研究将会为菌株的流行和耐药性产生的相关性提供更精确的数据,对制定正确的TB预防和控制策略具有重要意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突