马源人乳头瘤病毒18 型的鉴定及遗传进化分析

谢金鑫，张敖云图雅，闫永涛，张 磊，宋小珍，贾陈阳，况 玲，佟盼盼

（新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

乳头瘤病毒（Papillomavirus，PV）属于乳多空病毒科（Papillomaviridae）家族，是一种小的无包膜的双链DNA 病毒，主要感染人和动物的皮肤和粘膜上皮细胞，诱发良性和恶性肿瘤[1]。已知有193 种HPV 类型，其中15 种（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73 和HPV82）被列为高风险型，HPV主要通过性接触传播，还可能经手、围产期、血液和空气等方式传播[2]。在其他动物中也有乳头瘤病毒的报道，目前已检测到9 种马乳头瘤病毒（Equus caballus papillomavirus，EcPVs），24 种 牛 乳 头 瘤 病 毒（Bovine papillomavirus，BPV），其 中BPV1、BPV2 和BPV13 可感染马，BPV1 和BPV2 是引起马肉瘤的主要致病病原[3-9]。

HPV18 是仅次于HPV16 的高风险型HPV，研究显示HPV18 感染与多种肿瘤的发生有关，E6、E7癌基因在细胞转化中起着重要作用[9]。目前尚未发现动物携带HPV18[1,10-11]。本研究首次鉴定了马源HPV18 并对其E6 基因进行遗传进化分析，为HPV18的流行病学研究提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 样 品 本实验室于2018 年5 月，从新疆昌吉市和伊宁市马场采集每匹马的粪便、血清和鼻拭子共3 类样品，采集的纯血马共计30 匹，本土马共计147 匹。

1.2 主要试剂 Viral Nucleic Acid Extraction Kit 购自Geneaid 公司；胶回收试剂盒购自OMEGA BIO-TEK公 司； DL2000 DNA Marker、 Reverse Transcriptase M-MLV、Klenow Fragment、Ribonuclease H、Ex Taq等购自TaKaRa 公司。

1.3 病毒宏基因组学分析 参考文献[12]对采集粪便样品进行病毒富集、核酸提取和反转录，采用随机引物对cDNA 进行PCR 扩增，获得的DNA 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测、纯化，合格后由上海派森诺生物技术股份有限公司进行高通量测序（Illumina HiSeq X-ten）和病毒宏基因组学分析。

1.4 引物设计 参照HPV18（JN416217、MF288702和KC470212 等）E6 基因，采用Primer 5.0 软件设计特异性引物：5'-ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAAC-3'/5'-TTATACTTGTGTTTCTCTGCGTCG-3'，由上海派森诺生物技术股份有限公司青岛合成部合成。

1.5 样品中HPV E6 基因的PCR 扩增及序列测定根据参考文献[12]对采集的粪便、鼻拭子样品进行处理后，利用Geneaid 试剂盒提取样品中的病毒DNA 为模板，采用1.4 的引物PCR 扩增E6 基因，反应条件：94 ℃3 min；94 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃1 min，共34 个循环，72 ℃10 min，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 E6 基因的同源性及其氨基酸序列遗传进化分析 根据GenBank 中登录的相关PV 序列，采用DNAstar 软件对获得的马源HPV18 E6 基因核苷酸和氨基酸序列与HPV18及EcPVs E6基因核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析。利用MEGA7.0.26软件采用最大似然法（Maximum Likelihood methods）构建E6 氨基酸序列系统进化树，步展值重复1 000 次进行评估。

2 结果与讨论

2.1 病毒宏基因组学分析 对采集的马粪便样品经常归处理、PCR 扩增后经病毒宏基因组学分析显示，共获得76 986 684 个测序读长，有197 056（0.26%）个测序读长注释到哺乳动物病毒，其中42个测序读长注释到HPV18，进一步拼接成7 条Contigs，Contigs 与HPV18 E6 基因编码的氨基酸序列同源性为91.8%～100%，平均读长1 500 nt。表明马粪便样品携带HPV18。

2.2 样品中马源HPV18 E6 基因的PCR 扩增及分析结果 通过特异性PCR 检测，在30 份纯血马粪便样品中有6 份呈HPV18 阳性，阳性率为20%，部分纯血马粪便样品HPV18 E6 基因的PCR 扩增结果见图1；与纯血马同场饲养的本土马粪便样品中HPV18 阳性率为12.7%（7/55）；而非同场饲养的本土马粪便样品呈HPV18 阴性，表明马源HPV18 可能是由纯血马携带的病毒。此外，在纯血公、母马粪便样品中均检测到HPV18，表明纯血马携带HPV18跟其性别没有关系。在177 匹马鼻拭子和血清样品中均未检测到HPV18，表明该病毒可能仅存在于马肠道中，但HPV18 阳性马并未观察到明显的临床症状。HPV18 可引起人的消化道肿瘤[13]，尚未见其经消化道传播的报道。本研究首次在动物肠道中检测到HPV18。13 份HPV 阳性马粪便样品中HPV18 E6基因核苷酸序列同源性为100%，将样品编号为S1的纯血马源HPV18 E6 基因序列提交至GenBank，获得登录号为MN164461，并命名为XJ-CJS1。

图1 部分纯血马粪便样品HPV18 E6 基因的PCR 扩增结果Fig.1 PCR detection of E6 gene in samples of thoroughbred feces

2.3 HPV E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析利用MegAlign 软件将XJ-CJS1 株E6 基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank 登录的21 条HPV18、9 条马乳头瘤病毒（EcPVs）E6 基因核苷酸和氨基酸序列比对分析结果显示，XJ-CJS1株E6基因核苷酸和氨基酸序列与西班牙（LSM7 株）、荷兰（C644657、1445230、1193039、1447457、C506270 和C627893 株）、美国（Qv26861、Qv15957 等3 株）、德国（X04773 株）、泰国（CU10 株）、巴西（pam9 株）及日本（M20325 株）的HPV18 E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.6%～100%、100%，而与我国HPV18（P1-10、P2-20、P1-20、P1-30、P2-30、P1-40 和P1-50 株）E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.6%～97.3%、91.8%～96.8%，与EcPVs E6 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为35.8%～40.1%、14.6%～24.6%。表明马源HPV18 可能是由纯血马携带的外来病毒。

2.4 HPV E6氨基酸序列遗传进化树分析 以上述21株HPV18和9株EcPVs为参考株，利用MEGA7.0.26软件构建E6 氨基酸序列进化树。结果显示XJ-CJS1 株与21 株HPV18 均属同一进化分支，并与西班牙、荷兰、美国、德国、日本、巴西、泰国人源HPV18 参考株亲缘关系较近，但与9 株EcPVs 属于不同分支（图2），进一步表明马源HPV18 是由纯血马携带的外来病毒，并与国外HPV18 亲缘关系较近，推测该病毒可能由人传至纯血马，要引起足够的重视。

图2 HPV E6 氨基酸序列的遗传进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of E6 amino acid sequence in HPV

HPV18 是能够通过直接接触传播的一类病毒，E6 癌基因在细胞转化中起着重要作用，在很多肿瘤及癌症中均可以检测到HPV[10]。99%以上的宫颈癌均与HPV 感染有关[14]，尽管未观察到马携带HPV18 表现出明显的临床症状，但马携带HPV18具有潜在感染人的风险，对公共卫生安全会产生威胁。本研究首次鉴定了马源HPV18 并对其E6 氨基酸序列进行遗传进化分析，为HPV18的流行病学研究提供了参考依据。