奶牛乳房炎无乳链球菌Fc-Sip 和金黄色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA 亚单位疫苗的免疫试验研究

李松建，周雅坪，吕天星，杜 琳，郭 婷，郝永清

（内蒙古农业大学 兽医微生物学与免疫学实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

FcRn 首次在新生啮齿动物的肠道中被发现，当啮齿类动物断奶后，FcRn 在肠道中的表达量明显下降[1]。Israel 等研究发现，FcRn 不仅仅在新生儿的体内表达，而且在成年人和哺乳动物的一些组织当中同样有所表达，如人的血管内皮细胞、小肠上皮细胞和合胞体滋养层等等[2]。牛和猪的乳腺上皮细胞、小肠上皮细胞和肺组织等部位均有FcRn的表达[3]。张怡等发现，FcRn 介导单纯疱疹病毒（HSV）特异性抗原可穿过极化的HEC-1-A 细胞发挥局部粘膜免疫保护作用，防止疱疹病毒入侵细胞[4]。FcRn 能够与IgG 分子和白蛋白相互结合，防止IgG 分子和白蛋白被递呈到溶酶体中降解[5]，延长了IgG 分子和白蛋白的半衰期[6]。Ye 等研究发现FcRn 的介导下通过了呼吸道粘膜屏障转运HSV-2gD 至血液，有效促进了局部粘膜免疫和体液免疫的发生[7]。

近年来，关于无乳链球菌（S.agalactiae，Sgc）的荚膜、表面蛋白等有效靶点制备抗原的研究很多，但是目前还没有高效、市场化的无乳链球菌疫苗问世，因此，无乳链球菌性奶牛乳房炎仍是一个奶牛养殖业亟待解决的问题。同样，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sau）的疫苗仍在研究阶段，Shkreta 等串联金黄色葡萄球菌ClfA 和FnBPs，制成二价核酸疫苗对奶牛进行首次免疫，第二次免疫使用相应基因的亚单位疫苗加强免疫，结果表明，混合使用金黄色葡萄球菌核酸疫苗和亚单位疫苗能够有效地刺激奶牛发生特异性免疫反应[8]。但考虑到这种方法成本较高、操作繁杂，对于大型奶牛养殖场很难采用这种疫苗进行免疫。基因工程苗、亚单位疫苗不但可以有效避免利用全病原体生产疫苗而导致的生物安全风险，而且有利于提高疫苗中有效成分的浓度、纯度，是目前疫苗产业新的研究趋势[9]。因此，本研究在前期研究基础上制备亚单位疫苗Fc-Sip，Fc-FnBPB-ClfA，进行免疫试验，以期达到良好免疫效果。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 含pET22b-Fc-Sip 质粒的菌株、含pET32a-Fc-FnBPB-ClfA 质粒的菌株均由内蒙古农业大学兽医学院微生物与免疫学实验室保存；实验用奶牛购自内蒙古鄂尔多斯市达拉特旗某牧场；IPTG（1 mol/L）、透析袋（8 000 ku～14 000 ku）购自北京索莱宝生物科技有限公司；TMB 底物溶液购自天根生化科技有限公司；盐酸左旋咪唑（LH）购自吉林和元生物工程有限公司；兔抗牛HRP-IgG 购自海博生物技术有限公司；BCA 改良型蛋白定量试剂盒、30%丙烯酰胺、TEMED、His 镍层析柱均购自生工（上海）生物工程股份有限公司；利拉伐CMT 检测试剂购自兰州伟国牧场用品商贸公司。

1.2 亚单位疫苗的制备 按常规方法将含pET-22b-Fc-Sip 质 粒 和pET-32a-Fc-FnBPB-ClfA 质 粒 的菌株分别进行原核表达，将表达出的上清蛋白经纯化、浓缩，使用BCA 改良型蛋白定量试剂盒测定Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 蛋 白 浓 度，按 体 积1∶1 的比例将上述两种蛋白分别与1%的盐酸左旋咪唑（1%LH）充分混合，制备成Fc-Sip 亚单位疫苗和Fc-FnBPB-ClfA 亚单位疫苗。

1.3 动物试验设计 将临近干奶期前15 d、1～3 胎次奶牛进行乳样CMT 检测，将CMT 检测（++）以上的40 头奶牛随机分成A 组、B 组、C 组、对照组，每 组10 头。A 组 免 疫Fc-Sip + Fc-FnBPB-ClfA 二 联亚单位疫苗，B 组免疫无乳链球菌Fc-Sip 亚单位疫苗免疫，C 组免疫金黄色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗，对照组注射盐酸左旋咪唑（0.9%LH）。A、B、C 3 组均以蛋白含量为5 mg/头（2mL）经肌肉注射免疫，对照组注射2 mL 0.9%盐酸左旋咪唑。14 d 后，A、B、C 3 组均以蛋白含量为10 mg/头（4 mL）进行乳头管灌注二次免疫，对照组灌注4 mL 1%盐酸左旋咪唑，灌注免疫结束后使用干奶剂封闭乳头管。具体实验设计见表1。

表1 试验动物免疫程序设计Table 1 Experimental animal immunization program

1.4 免疫前后奶牛乳样中细菌的鉴定 免疫前和首免90 d 后分别采集各试验组乳样50 mL，划线接种至高盐甘露醇平板培养基、TSB 平板培养基和伊红美蓝平板培养基，37 ℃培养24 h。金黄色葡萄球菌的菌落在高盐甘露醇平板培养基上呈金黄色；大肠杆菌在伊红美蓝平板培养基上呈黑色金属光泽；葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌等均可在TSB 平板培养基上生长，根据菌落大小形态特点，提取各平板培养基上单个菌落的基因组，按常规方法进行16S DNA PCR 鉴定细菌类别。

1.5 体细胞数的测定 利用利拉伐牛奶体细胞检测仪检测免疫前和首免90 d 后各组试验奶牛乳样中的体细胞数。根据CMT 检测标准（表2），以CMT（++）以上，即乳中体细胞数大于4.0×105个/mL 的奶牛判定为隐性乳房炎奶牛；以CMT（+++）以上，即乳中体细胞数大于8.0×105个/mL 的奶牛判定为临床型乳房炎奶牛。

表2 CMT 检测标准Table 2 CMT test standard

1.6 试验奶牛免疫血清中特异性抗体的监测 免疫后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d 分别采集各实验组奶牛尾静脉血液10 mL，制备血清。将测定浓度后的Fc-Sip 蛋白和Fc-FnBPB-ClfA蛋白分别作为包被抗原，使用包被液将其分别稀释至3 μg/mL 和5 μg/mL，4 ℃过夜包被酶标板；10%脱脂乳封闭酶标板；以免疫后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d 的奶牛血清倍比稀释后作为一抗，兔抗牛HRG-IgG（1∶6 000）作为二抗，以间接ELISA 的方法检测各试验组和对照组奶牛血清中的抗体水平，作3 个平行对照。

2 结 果

2.1 Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 蛋白纯化结果 将Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 经原核表达后，取其上清蛋白经镍层析柱纯化，利用透析浓缩蛋白，取适量浓缩后的蛋白进行SDS-PAGE 检测，蛋白纯化结果见图1。将Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 纯化后的蛋白浓缩后测定其蛋白浓度分别为2.5 mg/mL 和2.7 mg/mL。

2.2 乳样中细菌分离结果 免疫组（A、B、C）免疫前后乳样划线培养后，利用16S DNA 检测其中病原菌，结果显示，免疫前免疫组（A、B、C）奶牛的乳样细菌分离率分别为80%、90%、80%，其中Sgc检出率分别为20%、30%、10%，Sau 检出率分别为30%、20%、10%；90 d 后3 个免疫组奶牛乳样细菌分离率分别降至20%、20%、40%，其中Sgc 的检出率分别降至0、0、10%，Sau 的检出率分别降至10%、10%、0。对照组免疫前与首免90 d 后的细菌检出率均为80%。免疫组（A、B、C）首免90 d后乳样中无乳链球菌检出率和金黄色葡萄球菌检出率比免疫前显著降低（p＜0.05）（表3）。表明试验所用亚单位疫苗可治疗无乳链球菌性和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎。

图1 Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 蛋白的纯化结果Fig.1 Purification results of Fc-Sip and Fc-FnBPB-ClfA protein

表3 分菌与体细胞测定结果Table 3 Results of bacterial isolation and somatic cell detection

续表

2.3 乳样中体细胞数测定结果 牛奶中的体细胞通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性粒白细胞和少量的乳腺组织上皮细胞等组成。当奶牛泌乳系统受不同种类病原的侵袭而发生感染时，乳房组织分泌的乳汁中体细胞数随即大幅度上升[10]。使用利拉伐体细胞检测仪测定免疫前与首免90 d后各试验组奶牛乳样的体细胞数，结果显示（表3），免疫前免疫组（A、B、C）奶牛体细胞数均值分别为6.19×105个/mL、5.16×105个/mL、5.49×105个/mL，首免90 d后3个免疫组奶牛乳样中体细胞数均值分别为2.05×105个/mL、2.04×105个/mL、2.52×105个/mL，而对照组奶牛乳样体细胞数免疫前后无明显变化。对比表3 中2.2 结果可知，牛奶中体细胞数的变化在一定程度上取决于奶牛乳腺组织是否被病原微生物感染，因此该体细胞检测结果表明试验所用亚单位疫苗降低了乳腺感染程度。

2.4 免疫血清抗体水平检测结果 采用间接ELISA方法检测各试验组和对照组奶牛血清中的抗体水平，结果显示，对照组奶牛血清中Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 抗体滴度分别保持在1∶256、1∶512 的水平。首免后7 d，A 组、B 组80%的奶牛血清中Fc-Sip 抗体滴度达到1∶512，A 组、C 组80%的奶牛血清中Fc-FnBPB-ClfA 抗体滴度达到1∶1 024；第14 d 后，血清抗体滴度均明显升高，A 组、B 组90%奶牛血清中Fc-Sip 抗体滴度达到1∶1 024，A 组、C 组80%奶牛血清中Fc-FnBPB-ClfA 抗体滴度达到1∶2 048；第28 d 后，A 组、B 组70%奶牛血清Fc-Sip 抗体滴度在1∶2 048～1∶4 096，A 组、C 组80%奶牛血清Fc-Fn-BPB-ClfA 抗体滴度在1∶4 096～1∶8 192，第60 d 后，免疫各组的血清抗体滴度呈现下降趋势（图2）。

图2 免疫牛血清抗体检测结果Fig.2 Antibody titer in immunized bovine serum

综合分析各组检测结果可见A 组Fc-Sip+Fc-Fn-BPB-ClfA 二联亚单位疫苗综合免疫效果最佳。表明Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA 二联亚单位疫苗不仅有效促进奶牛体液免疫反应，还对无乳链球菌性和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有一定的治疗作用。

3 讨 论

已有研究证实了包括无乳链球菌在内的链球菌属全菌体灭活苗对奶牛的保护力较弱，而研究较多的荚膜多糖疫苗等也缺乏广泛的保护力，免疫保护效果均不理想[11]。这可能是该菌本身抗原结构较复杂，已鉴定的不同种血清型无乳链球菌之间缺乏交叉保护力。通常情况下，无乳链球菌的毒力因子和抗原因子在同一标靶组分上，而标靶蛋白只有在细菌细胞保持完整活状态下才能发挥其毒力作用，而其抗原性在亚单位状态下仍会存在[12]。因此，将亚单位有效标靶蛋白作为重点研究对象，已成为该领域的研究热点。

本实验室前期对奶牛乳房炎亚单位疫苗的研究中，分别筛选了铝胶盐佐剂、蜂胶佐剂、大肠肝菌热不稳定肠毒素佐剂（LTB）等，但均不理想。近年来FnRn 在介导免疫方面研究较多，但FcRn 与IgG 分子结合依赖于pH 环境，当pH 小于7.0 即酸性条件下，FcRn 可以与IgG 分子结合，当pH 大于7.0 即碱性条件下，FcRn 与IgG 分子不结合，另外盐酸左旋咪唑佐剂（LH）具有免疫调节和免疫兴奋的功能[13]。因此，由IgG FcRn介导保护性抗原的亚单位疫苗使用偏酸性佐剂最为合适。所以，本研究采用1%LH作为佐剂。

病原菌引起的奶牛乳房炎涉及十多个属的细菌，其中葡萄球菌属、链球菌属和大肠埃希菌属在乳房炎牛乳中分离率约占90%[14]。本研究通过免疫后细菌分离率、无乳链球菌检出率、金黄色葡萄球菌检出率及其它乳房炎致病菌均有减少，说明Fc-Sip 亚单位疫苗和Fc-FnBPB-ClfA 亚单位疫苗免疫可提高牛体免疫力，不但降低了无乳链球菌和金黄色葡萄球菌，而且还抑制了其它奶牛乳房炎致病菌的侵入；牛乳中体细胞数不仅是评价牛奶质量的重要指标[15]，而且是乳腺受病原侵袭后导致的感染程度的指标[10]。本实验免疫后牛乳中的体细胞数比免疫前明显下降，免疫A、B、C 组牛乳中体细胞数均值小于3×105个/mL，而免疫前后对照组牛乳中体细胞数无明显变化，证明本实验所用亚单位疫苗具有降低感染牛乳腺感染程度的作用。抗体滴度变化情况是疫苗免疫效果评价的重要指标，本研究利用间接ELISA 检测各组免疫前后抗体水平变化，结果显示，免疫A 组抗体滴度比对照组平均上升3 至4个抗体滴度；免疫B 组抗体滴度比对照组平均上升2 至3 个抗体滴度；免疫C 组抗体滴度比对照组平均上升3 个抗体滴度，A 组抗体滴度升高最为明显。有研究显示，FcRn 参与乳腺对IgG 的胞吞转运和保护IgG 分子免受降解，提高牛乳中IgG 的含量[16]，本研究利用FcRn 串联表达的重组亚单位疫苗免疫后抗体检测结果进一步印证了该结论。

无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎均具有高度传染性，常引起奶牛隐性乳房炎，影响泌乳量，给奶牛养殖业带来经济损失。目前，还没有研制出市场化的无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗。本实验室致力于研究奶牛乳房炎疫苗多年，对于如何诱导机体产生有效、快速的乳房局部免疫反应有了新的突破，在杨岚、杜琳、赵红梅等的研究中已经从疫苗的研制阶段到本动物的免疫试验及最后免疫效果的评价，免疫佐剂选择等方面建立了一套完整的模型[17-18]。本研究通过免疫试验，探究了Fc-Sip 和Fc-FnBPB-ClfA 亚单位疫苗的免疫效果，为无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的开发提供了技术支持。