STING 蛋白在绵羊原代肺泡巨噬细胞的表达与生物信息学分析

郝秀静，韩 杨，潘群元，金 华，马春骥，罗海霞，李 敏*

（1. 宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2. 宁夏大学 生命科学学院，宁夏 银川 750021）

干扰素基因刺激因子（Stimulator of inerferon gene，STING）作为近年来新发现的固有免疫信号通路关键接头蛋白，在机体抵抗病原体侵入过程中发挥重要作用[1-2]。当机体被感染时，STING 可直接识别病原体释放的环二核苷酸（Cyclic di-nucleotides，CDNs），使自身活化，并募集TANK 结合激酶（TBK1）形成复合物， 该复合物进一步激活干扰素刺激因子3（IRF-3）并使其磷酸化后转移至核内，诱导Ⅰ型IFN及IFN 刺激基因（Interferon stimulate genes，ISG）的表达，激活机体固有免疫反应[3-5]。由环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（cGAS）合成的cGAMP 是真核细胞细胞质中DNA 的主要传感器之一，也可以激活STING 信号通路[6-8]。此外，位于细胞核或者线粒体中的自体DNA一旦泄露到细胞质中，STING 可能会被过度激活引起自身免疫性疾病[9]。2018 年Ahn 等人的研究还发现STING 信号通路在抗肿瘤免疫中也发挥着重要的作用，为肿瘤治疗提供了一个新方案[10]。

目前在哺乳动物如人和小鼠中发现STING 蛋白在 其N 端（aa1～aa137）包 含4 个 跨 膜 区 域，C 端（aa138～aa397）延伸至胞质中，可以感知胞浆中的二核苷酸以及招募下游相关因子[11]。STING 一般以二聚体的形式存在，STING 蛋白的活化、抑制或者过度激活与该聚合体的结构直接相关[12]。人的STING蛋白位于内质网中，当STING 被活化后，其构象发生变化，并募集TBK1，形成STING 复合体，该复合体发生膜运输，经过高尔基体到达核周。但有关绵羊原代肺泡巨噬细胞中的STING 蛋白还未见报道。宁夏地处西北，养殖业资源丰富，绵羊是其主要的养殖物种，但疾病的发生阻碍了绵羊养殖业的发展，特别是羊传染性胸膜肺炎的发生给羊养殖业带来重大的经济损失，因此对绵羊抗感染相关基因的探究特别是针对其呼吸道第一道防线——绵羊肺泡巨噬细胞中抗感染基因的发现对于该病的防控具有重要意义。为此，本研究首先证明了绵羊原代肺泡巨噬细胞中含有sting 基因，明确了STING 蛋白在绵羊原代肺泡巨噬细胞中的表达；利用免疫荧光技术以及激光共聚焦对STING 蛋白进行定位，并进行了生物信息学分析，以期为后续深入研究STING 蛋白在绵羊肺泡巨噬细胞中发挥固有免疫作用的相关机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体 大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T 载体购自TaKaRa 公司。

1.2 主要试剂 限制性内切酶NdeI、EcoRI、T4 连接酶、IPTG、RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、2×TaqPCR Master Mix 试剂盒、质粒小提试剂盒、DL2000 DNA Marker 等购自天根生化科技（北京）有限公司；细胞总蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司；酵母提取物（Yeast extract）、胰蛋白酶（Tryptone）购自OXOID 公司；DMEM 细胞培养基和胎牛血清购自Gibco 公司；Protein Marker 购自全式金（北京）有限公司；FITC 标注的抗CD14 抗体（人源）购自Abcam 公司；兔抗TMEM173/STING 多克隆抗体、HRP 标记山羊抗兔IgG、鼠抗ERp72 单克隆抗体（MAb）、Alexa Fluor488山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG 购自Proteintech公司；底物显色试剂盒购自GE 公司。

1.3 绵羊原代肺泡巨噬细胞的分离、培养与纯度鉴定 取新鲜的6 月龄的绵羊肺脏组织，通过其气管顶部灌入含有2.5 μg/mL 两性霉素B、100 μg/mL 氨苄青霉素、25 μg/mL 庆大霉素的PBS 缓冲液，待肺叶膨胀后轻轻按摩肺叶，然后将肺脏灌洗液经气管顶部倒出，并用两层已灭菌的医用纱布将其过滤至无菌瓶中，900 r/min 离心5 min，取沉淀物置于20%胎牛血清的DMEM 高糖细胞培养液重悬，于37 ℃5%CO2培养，每1 h～2 h 更换培养基。利用显微镜对分离培养的已贴壁细胞进行形态学观察。制备细胞爬片，以FITC 标记的抗肺泡巨噬细胞表面特异性抗原CD14 的抗体（1∶100）对分离培养的细胞进行标记，DAPI 避光孵育5 min 进行核染，通过荧光显微镜观察并鉴定分离的绵羊原代肺泡巨噬细胞的纯度。

1.4 绵羊原代肺泡巨噬细胞sting 基因的PCR 扩增及测序 提取绵羊原代巨噬细胞总RNA，反转录为cDNA 后作为PCR 模板,采用上下游引物：stingF：ATGCCTCACTCCAGCCTGCAT/ stingR： TCAGAAGACATCTGAGCGGA 进行PCR 扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应程序为：95 ℃5 min；94 ℃1 min，62 ℃30 s，72 ℃1 min，30 个循环，72 ℃5 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收连接于pMD18-T 载体，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定。

1.5 绵羊原代肺泡巨噬细胞中STING 蛋白的western blot 鉴定 提取已分离鉴定的绵羊原代肺泡巨噬细胞总蛋白，使用BCA 检测试剂盒对所提蛋白浓度测定后，以兔抗TMEM173/STING 多克隆抗体（1∶1 000）为一抗，HRP 标记山羊抗兔IgG（1∶10 000）为二抗，经western blot 鉴定细胞中的STING 蛋白。

1.6 绵羊原代肺泡巨噬细胞中STING 蛋白的定位检测 收集生长状态良好的绵羊原代肺泡巨噬细胞，制成细胞悬液，将5×104个/mL细胞接种于200 mm激光共聚焦小皿，用4%的多聚甲醛固定细胞10 min，0.5%Triton X-100 室温通透20 min，封闭30 min 后以兔抗TMEM173/STING 多克隆抗体（1∶1 000）与鼠抗ERp72 MAb（1∶1 000）为一抗，以Alexa Fluor 488 标记的羊抗鼠IgG（1∶500）和Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔IgG（1∶500）为二抗，37 ℃孵育1 h，滴加DAPI 避光孵育5 min，激光共聚焦显微镜下选取多个视野观察并采集图像。

1.7 绵羊原代肺泡巨噬细胞中STING 蛋白的生物信息学分析 使用生物信息学SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）软 件 对STING 蛋白质信号肽进行分析；利用生物信息学软件HMMER （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/） 对STING 的蛋白质结构域以及跨膜结构进行分析；利用生物信息学软件Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/）对STING 蛋白的三维结构进行分析。

2 结 果

2.1 绵羊原代肺泡巨噬细胞的分离、培养与纯度鉴定将分离的绵羊原代肺泡巨噬细胞贴壁培养，通过反复换液的方式，去除未贴壁的细胞，经显微镜观察可见分离获得的细胞具典型的巨噬细胞形态学特征，胞体较大，呈圆形或椭圆形，有伪足和突起伸出。对分离的绵羊原代肺泡巨噬细胞加入FITC标记的抗CD14的抗体进行标记，与细胞核染结果重叠对比，结果显示，分离的细胞基本被CD14的抗体标记（图1）。表明，分离得到了纯度较高的绵羊原代肺泡巨噬细胞。

图1 绵羊原代肺泡巨噬细胞的鉴定结果Fig.1 Dentification of primary alveolar macrophages in sheep

2.2 绵羊原代肺泡巨噬细胞sting 基因及蛋白的检测结果 以绵羊肺泡巨噬细胞总RNA 反转录后的cDNA 为模板进行PCR 扩增后，结果显示扩增的基因片段约1 100 bp，与预期一致（图2A）；测序结果显示，测序基因序列与sting 基因序列一致。表明绵羊原代肺泡巨噬细胞中存在sting 基因。通过western blot 对绵羊原代肺泡巨噬细胞STING 蛋白进行检测，结果显示，在40 ku 处有目的蛋白条带，与预期相符（图2B）。表明绵羊原代肺泡巨噬细胞中STING 蛋白得到了表达。

图2 sting 基因的PCR 扩增（A）及其蛋白的westenblot 鉴定（B）结果Fig.2 PCR amplification of the sting gene(A)and westen blot identification(B)of the target protein

2.3 STING 蛋白在绵羊原代肺泡巨噬细胞中的定位检测结果 通过间接免疫荧光试验对绵羊原代肺泡巨噬细胞中的STING 蛋白进行定位，激光共聚焦显微镜观察结果可见STING 蛋白与内质网特异性标记蛋白ERp72 相重叠（图3），初步认为STING 蛋白定位在绵羊原代肺泡巨噬细胞的内质网中。

2.4 绵羊原代肺泡巨噬细胞中STING 蛋白的生物信息学分析结果 经SignalIP5.0 软件对STING 蛋白的信号肽预测分析，结果显示该蛋白aa1～aa37 之间存在信号肽，其切割位点位于第38 位的谷氨酸（Glu）和第39位的脯氨酸（Pro）之间（图4）。使用HMMER软件对其进行结构分析，结果显示该蛋白存在TMEM173结构域，有3个潜在跨膜区，分别是aa21～aa37、aa84～aa107、aa119～aa140。利用生物信息学软件Swiss model 做STING 蛋白二聚体的三维结构呈蝴蝶状，与目前已报道的其他物种的STING蛋白二聚体结构一致（图5）。通过对STING 蛋白信号肽序列进行预测，可以为更加深入细致的研究STING 蛋白的定位奠定基础；通过对STING蛋白结构的分析，为后续深入探究STING蛋白在固有免疫中的作用机制奠定基础。

图3 STING 蛋白在绵羊原代肺泡巨噬细胞中定位的检测结果Fig.3 Location of STING protein in primary alveolar macrophages of sheep

图4 STING 蛋白的信号肽分析图Fig.4 Signal peptide analysis of STING protein

图5 STING 蛋白质的三维结构图Fig.5 Three-dimensional structure of STING protein

3 讨 论

天然免疫是宿主抵御病原体感染的第一道防线，在机体抵抗病原体侵入中发挥重要作用[13]，天然免疫相关细胞通过其表面的模式识别受体识别病原相关分子模式，激活机体的固有免疫应答，STING 蛋白作为重要的天然免疫信号通路关键接头蛋白不仅在抗感染免疫中发挥着重要的作用，在自身免疫性疾病以及抗肿瘤的免疫中也发挥着重要作用[14-16]。部分学者认为，活化的STING 也可磷酸化IKB 激酶（IKB Kinase，IKK）以解除NF-κB 的抑制状态，从而上调促炎细胞因子的表达[17-18]。Muhammet F 等人研究显示cGAS-STING 通路的激活会触发原发性或恶性T 细胞的凋亡[19]。婴儿期起病的血管病（SAVI）与STING 的6 个位点突变有关[12]。该蛋白在多种细胞中表达，其中与免疫相关的细胞表达量高。鉴于STING 蛋白功能的重要性，有待对STING 蛋白进行更深入的研究。

绵羊传染性胸膜肺炎严重影响了羊养殖业的发展，绵羊肺泡巨噬细胞的抗感染相关基因的发现与研究对于该病的防控具有重要意义。该细胞中的STING 蛋白目前还未见报道，对其进行深入研究的一个关键环节是获取高纯度的绵羊原代肺泡巨噬细胞，在制备该细胞过程中，因为收集的肺脏灌洗液中含有大量的红细胞，本研究最初尝试加入红细胞裂解液去除红细胞，但肺泡巨噬细胞的整体活性又受到影响，后来利用肺泡巨噬细胞贴壁的特性，通过多次换液去除细胞培养液中的红细胞，最终获得了高纯度的绵羊原代肺泡巨噬细胞。

利用分离到的绵羊原代肺泡巨噬细胞，通过PCR 检测到该细胞中存在sting 基因。western blot 进一步表明STING 蛋白在该细胞中的表达。但是关于STING 蛋白的定位仍然存在一些争议，信号肽一方面决定一个蛋白质是否为分泌蛋白，此外和蛋白质或其新生肽链在细胞内的定位有关，经Signal IP 5.0软件对STING 蛋白的信号肽预测分析，结果显示该蛋白aa1～aa37 之间存在信号肽。利用免疫荧光技术经激光共聚焦显微镜观察，初步明确了绵羊原代肺泡巨噬细胞中的STING 蛋白定位在该细胞的内质网中。本研究为深入探索STING 蛋白在绵羊肺泡巨噬细胞中发挥固有免疫作用的相关机制奠定基础。