中国氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌gyr基因序列特征分析

孟繁荣 杨瑜 雷杰 王楠 李华 谢贝 邓丽 牛群 竺澎波 高俊文 刘志辉

广东省广州市胸科医院肺部疾病研究所，呼吸疾病国家重点实验室结核病实验室（广州510095）

氟喹诺酮类（fluoroquinolones，FQs）药物因其具有稳定高效的抗结核作用被世界卫生组织推荐为耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）化学治疗的A 类药物［1］，也是我国MDRTB 治疗方案中的首选用药［2］，然而随着其广泛应用，结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）对氟喹诺酮类药物的耐受也日益引起人们关注。目前人们将快速药敏试验的方法聚焦于分子生物学检测技术。研究［3］表明，结核分枝杆菌对氟喹诺酮药物的耐受主要缘于该类药物作用靶位DNA解旋酶的编码基因gyr 突变。世界卫生组织于2016年推荐将分子线性探针技术直接应用于结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物的耐药性诊断［4］，已在世界各地得到广泛应用。然而，由于结核分枝杆菌的遗传背景［5］和环境因素的不同影响，目前关于氟喹诺酮药物耐药基因突变位点和突变类型及频率的报道在各个国家和地区差异较大［6-8］。为充分评估现有二代线性探针技术对我国结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药性诊断的适用性，本研究对我国氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌的gyr 基因序列进行了循证分析，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 检索策略以检索式“quinolones resistance AND Mycobacterium tuberculosis AND（China OR Hong Kong OR Tai Wan OR Macon）”和“喹诺酮耐药AND 结核”分别在英文数据库（pubmed、Embase、SciFinder）和中文数据库（万方、中国知网、中国生物医学文献服务系统与维普期刊资源服务平台）中检索截至2020年2月15日有关我国结核分枝杆菌氟喹诺酮类耐药基因突变的研究文献。

1.2 文献纳入与排除标准纳入标准：（1）所研究的结核分枝杆菌菌株均来自中国（包括香港、澳门和台湾地区）；（2）氟喹诺酮类药物耐药表型采用比例法或绝对浓度法测定；（3）氟喹诺酮耐药基因gyrA、gyrB 基因序列均采用DNA 测序方法获得；（4）报告需包括基因突变的位点，碱基或氨基酸变化信息，并且明确将双位点、多位点突变作为突变类型单独统计。排除标准：（1）以作者单位、文献出版时间、菌株数量及来源等信息排除重复报道的文献；（2）综述性文献；（3）中文和英文以外语种的文献。

1.3 文献筛选与数据提取通过浏览文题和摘要对文献进行初筛，对获得全文的文献由2 名专业人员严格按照纳入和排除标准独立进行数据提取和整理分析并交叉核对，内容包括：第一作者姓名、研究机构、Pubmed 标识码PMID、文献发表年度、菌株来源、菌株数量、突变位点、碱基或氨基酸变化、突变株数量等，数据提取和整理分析过程中出现的分歧则由第3 名研究者进行审定。

1.4 统计学方法应用Excel 2019 对纳入研究的文献中氟喹诺酮类耐药基因的突变信息进行录入合并，采用SPSS 19.0 进行统计学分析。应用频数、百分比指标进行计数资料的描述性分析；对结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药MDR 株与除氟喹诺酮外其它药物耐药情况不清晰的菌株，二者间的gyrA、gyrB 基因突变情况，应用行×列表资料的χ2检验进行多个样本率的比较，以P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 文献检索基本情况检索到文献共393 篇，后通过阅读文题和摘要初步剔除，得到60 篇外文和42 篇中文文献全文。通过阅读文献全文，严格执行纳入与剔除研究标准，最终32 篇外文和23 篇中文文献纳入研究。研究对象包括我国大陆地区福建、广东、四川、贵州、甘肃、西藏、河北、山东、浙江、湖南、黑龙江等26 个省、直辖市和我国香港、台湾地区从1996 至2020年以来的菌株。纳入文献的基本情况见表1。

2.2 3 641 株氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌株gyrA基因序列分析结果55 个研究共对3 641 株结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药株进行了gyrA 基因序列检测。2 830（77.73%）株氟喹诺酮耐药株存在gyrA基因突变，共47 种突变类型，无碱基缺失与插入突变，单位点和双位点突变的发生率分别为75.83%（2 760/3 641）和1.92%（70/3 641）。在基因突变类型中，94、90、91 位氨基酸位点突变较为常见，突变率分别为49.33%（1 796/3 641）、19.14%（697/3 641）、5.80%（211/3 641），其中，以出现频率由高到低计，前6 位突变类型分别是Asp94Gly、Ala90Val、Asp94Ala、Asp94Asn、Ser91Pro、Asp94Tyr。见表2。

表1 纳入文献基本情况Tab.1 Basic information of included documents

表2 3 641 株氟喹诺酮类耐药中国结核分枝杆菌株gyrA基因突变情况Tab.2 Distribution of mutations in gyrA in 3 641 FQ-resistant strains

2.3 1 958 株氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌株gyrB基因序列分析结果55 个研究中有29 项研究同时检测了氟喹诺酮耐药株gyrA 与gyrB 基因序列，共计1 958 株。175（8.94%）株氟喹诺酮耐药株发生了gyrB 基因突变，其中56 株的29 个突变类型包括500、424、543、485、540、551、447、461、498、504、511、512、538、508、539、98、425、434、486、517单位点与419/465、539/551 双位点为gyrB 单基因突变，占gyrB 序列突变的32%（56/175），总的突变率为2.86%；其余119 株的36 种突变类型则与gyrA基因突变共同发生，占gyrB 序列突变的68%（119/175），总的突变率为6.08%。见表3。

表3 1 958 株氟喹诺酮类耐药中国结核分枝杆菌gyrA、gyrB 基因突变情况Tab.3 Distribution of mutations in gyrA and gyrB in 1 958 FQ-resistant strains

2.4 结核分枝杆菌gyr 基因突变率在FQ 耐药MDR 株与除FQ 外其他药物耐药背景不清晰菌株间的差异在1 958株同时检测了gyrA与gyrB基因序列的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药菌株中，614 株为同时对利福平和异烟肼耐药MDR 株，对gyrA、gyrB 基因突变率在MDR 株与其它药物耐药背景不清晰菌株中的差异性进行了χ2检验，χ2值分别为0.715 和0.623，P值分别为0.398 和0.430，二者差异均无统计学意义。见表4。

表4 gyrA、gyrB 基因突变率在FQ 耐药MDR 株与除FQ 外其它药物耐药背景不明菌株中的差异性比较>Tab.4 Comparison of the mutation rates of gyrA and gyrB between MDR strains of FQ resistant and those with unknown information of drug resistance except FQ

3 讨论

氟喹诺酮作用于结核分枝杆菌的唯一靶标是DNA 解旋酶，通过抑制DNA 解旋酶活性，干扰DNA 复制而导致结核分枝杆菌死亡。DNA 解旋酶由2 个A 亚基和2 个B 亚基组成，分别由gyrA、gyrB基因编码，结核分枝杆菌对氟喹诺酮产生耐药的主要机制便是gyrA、gyrB 基因序列发生突变。

已有研究证实，在gyrA 基因中，Glu21Gln、Thr80Ala、Ser95Thr、Gly247Ser 和Gly668D 位密码子突变是结核分枝杆菌gyrA 基因的天然多态性或遗传谱系标志物［7，9-11］，与氟喹诺酮的耐药性无关。纳入本循证分析的研究报道中，一项研究提及Glu21Gln 密码子突变，多项研究提及Ser95Thr 密码子突变，但均已言明该突变类型为gyrA 基因的遗传多态性表现，因此，文献中出现的这两个单位点突变，笔者将其归类为“无突变”，不计入gyrA 基因突变位点和类型的分析。本文所纳入的研究包括3 641 株氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌，均对gyrA基因进行了测序，其中1 958 株也同时检测了gyrB基因序列。本研究通过综合分析发现，我国结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药株检测到47 个gyrA 基因突变位点和类型，大部分发生在94、90 和91 位密码子，突变发生的频率由高到低依次为Asp94Gly、Ala90Val、Asp94Ala、Asp94Asn、Ser91Pro、Asp94Tyr，与其它两个结核病高负担国家印度和俄罗斯略有差异［12-16］。我国结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药株gyrA 基因总突变率为77.73%，与河北、四川、福建、重庆、天津等个别省市和地区［17-21］的差别较大，一方面是因为样本量的大小有差异，另一方面也进一步说明gyrA基因序列特征具有地域性差异，然而本文所分析的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药菌株包括中国大陆地区东、西、南、北、中大部分省份和各直辖市以及香港和台湾地区，且研究机构均为国内具有资质的高水平专业机构，本文的分析相当于多中心的研究，当能代表我国氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌gyrA基因突变的整体特征。与gyrA基因突变不同，结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药株gyrB 基因突变涉及的位点广泛而分散，发生率较低，为8.94%，且常与gyrA 基因的突变伴随发生，单基因突变发生率为2.86%。从利用分子生物学技术快速诊断耐药结核的角度来看，目前世界卫生组织推荐［22］的第二代线性探针技术可以检测gyrA 基因的Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Ala、Asp94Asn、Asp94Tyr、Asp94Gly、Asp94His和gyrB 基因的Asn499Asp、Glu501Val 密码子突变，根据本文的分析研究，包含上述检测位点的第二代线性探针技术可以检测到我国74.36% 的氟喹诺酮耐药结核，尚有5.57%发生gyr 基因突变的氟喹诺酮耐药结核不能被二代线性探针技术检测（我国氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌gyr 基因突变发生率为79.93%，1 565/1 958）。因此也应充分考虑除高发位点之外的其它突变位点和类型在我国耐药结核分子检测中的价值。

同时，纳入文献中的部分结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药株明确标明同时也是对利福平和异烟肼耐药的MDR 菌株，那么gyrA、gyrB 基因在FQ 耐药的MDR 菌株中突变发生率是否有别于除FQ 外其它药物耐药背景不清晰的菌株呢？我们也对此进行了差异性比较分析，发现无论是gyrA 基因还是gyrB 基因，其突变发生率在MDR 菌株与其它药物耐药背景不清晰的菌株中并差异无统计学意义，这也说明其它化疗药物的耐药背景对结核分枝杆菌gyr 基因突变发生率影响不大。

本研究通过循证分析发现，我国氟喹诺酮耐药的结核分枝杆菌中尚有21.07%未发现gyrA 或gyrB 基因突变，这可能是因为我国现有的研究大多集中在gyrA 与gyrB 基因的耐药决定区，而未对耐药决定区外的序列进行充分研究，但也提示仍有其它耐药机制尚待阐明。因此，在现有阶段分子生物学技术还不能完全取代传统的药物敏感试验来检测氟喹诺酮类药物的耐药性。同时，未来也应积极研究探索新的耐药机制，为更全面、精准、快速的检测手段的研发提供足够的理论依据。

本文的不足之处在于，没有对结核分枝杆菌gyr 基因突变位点、突变类型与氟喹诺酮耐药水平之间的关系进行分析，有研究表明gyr 基因突变位点和类型能够反映结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的低浓度或高浓度耐药［23-25］，然而针对这方面的研究目前报道并不多，还需进一步研究。