补肾壮骨颗粒对快速老化小鼠体质成分的影响

2020-07-01苏海容袁秋虹欧阳菁邓伟民

实用医学杂志 2020年11期

苏海容袁秋虹欧阳菁邓伟民

1南部战区总医院内六科（广州510010）；2广州中医药大学（广州510405）

随着我国人口老龄化的加剧，骨质疏松症（osteoporosis，OP）已成为我国面临的重要公共健康问题，严重威胁人们的健康及生活质量。前期研究发现老年男性的骨密度（bone mineral density，BMD）与总脂肪含量（total fat mass，TFM）和总肌肉含量（total lean mass，TLM）呈正相关［1］。老年人常有肌无力、骨骼肌含量减少、腹部脂肪增加、运动能力减退和骨密度降低等表现，这些与增龄引起生长激素（human growth hormone，GH）分泌不足有关，生长激素替代治疗可以提高肌肉含量及肌肉力量、减少脂肪含量和增加骨密度［2-3］，骨密度的增加可能与GH 治疗调节体质成分有关。但重组人生长激素（recombinant human growth hormone，rhGH）替代治疗仍有很多问题有待探讨：治疗的最佳剂量、是否引发恶性肿瘤及不良反应等［4-5］。补肾壮骨颗粒治疗骨质疏松症的疗效已得到证实［6］。本试验以快速老化雄性小鼠（senescence acceleratedmale mice，SAMP6，P6）为研究对象，采用皮下注射rhGH 及补肾壮骨颗粒灌胃治疗进行研究，再次验证补肾壮骨颗粒对老年男性骨质疏松症骨密度提高的有效性，探讨其对骨密度作用机理是否与调节体质成分有关，为临床应用提供更多的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物3月龄雄性SAMP6 品系小鼠共40只，正常老化同源对照小鼠SAMR1 共10 只，均由天津中医药大学第一附属医院实验动物中心提供（批号：No.12002900000012，清洁级）。

1.2 实验药物补肾壮骨颗粒（10 g/袋，广州军区广州总医院，批号15K04001），主要由龟板胶、鹿角胶、生地、山药、骨碎补、淫羊藿、水蛭等组成。尤得盼注射用rhGH（1.33 mg/瓶，（株）LG 生命科学，进口药品注册证号S20140029，生产批号UTR15020）。

1.3 实验器材双能X 线（DEXA）骨密度仪（生产厂家：美国GE 公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组与干预方法10 只3 个月龄雄性SAMR1 小鼠作为同源对照组。3月龄雄性SAMP6品系小鼠共40 只，分为4 组，每组各10 只。具体分组及干预情况见表1。

表1 实验动物分组及干预情况Tab.1 Grouping and intervention of experimental animals

所有小鼠在完全相同的条件下饲养，自由采食饮水。小鼠用药剂量根据人和动物体表面积与剂量换算比计算所得［7］，给药后每周称量体质量1 次，根据体质量调整受试药物剂量。干预3 个月后每组随机选取5 只进行测量骨密度及体质成分测量，剩下的再继续前方式干预，3 个月后采取同样的方法测量。

1.4.2 观察指标分别于干预3 个月和6 个月后，用双能X 线骨密度测量仪测对实验小鼠进行活体骨密度（BMD）、骨矿含量（BMC）、全身肌肉含量（TLM）、全身脂肪含量（TFM）及全身脂肪百分比（FM）检测。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以（）表示；多组间比较采用单因素方差分析，联合用药组的比较采用析因设计的方差分析，Boferoni 法校正，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量增长结果各组体质量在实验期间均随饲养时间延长而增加：（1）干预3 个月后，空白对照组较同源对照组体质量高（P＜0.05）；干预6 个月后，联合用药组较同源对照组体质量高（P＜0.05）。（2）两阶段干预后，P6 品系各组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），P6 品系组间具有齐同可比性。见表2。

表2 干预3 个月组及6 个月后体质量比较Tab.2 Comparison of Weight after 3 Months and 6 MonthsIntervention ±s，g

注：与同源对照组相比，*P ＜0.05；与空白对照组相比，△P ＜0.05；与补肾壮骨组比，#P ＜0.05；与rhGH 组相比，□P ＜0.05

组别同源对照组空白对照组补肾壮骨组rhGH 组联合用药组例数5 5 5 5 5干预3 个月25.80±1.92 29.60±1.95*31.00±0.71*29.6±1.82*30.80±1.30*干预6 个月26.40±0.89 30.80±2.50*31.80±2.59*30.60±2.88 30.20±1.48

2.2 TLM、TFM 和FM 比较TLM 比较：两阶段干预后均表现为：（1）同源对照组低于空白对照组（P＜0.05）；（2）rhGH 组、补肾壮骨组及联合用药组高于空白对照及同源对照组（P＜0.05）；3 组药物干预组比较差异差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

TFM 比较：两阶段干预后均表现为：（1）同源对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；（2）与空白对照组相比，rhGH 组、补肾壮骨组及联合用药组有所下降（P＜0.05）；但3 组用药药物干预组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

FM 比较：（1）3 个月干预后，同源对照组较空白对照组高（P＜0.05），干预6 个月后，此两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；（2）两阶段干预后，均表现为与空白对照组比较，rhGH 组、补肾壮骨组及联合用药组有所下降，3 组药物干预组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

各药物干预组小鼠的TLM、TFM 和FM（%）组间比较经析因设计的方差分析处理：总的校正模型均差异有统计学意义（均P＜0.05），干预3 个月及6 个月后发现，补肾壮骨颗粒与rhGH 间均存在负交互作用（F=5.521、7.118、13.697、9.484、10.667、27.334，均P＜0.05）。见表4 和图1。

表4 TLM、TFM 和FM 析因设计的方差分析Tab.4 Factorial design analysis of variance of TLM，TFM and FM

图1 两种药物对TLM、TFM 和FM 影响的交互作用示意图Fig.1 Factorial design analysis of variance of TLM，TFM and FM

表3 各组TLM、TFM 和FM 比较Tab.3 The Comparison of TLM，TFM and FM in each group ±s，g

注：与同源对照组相比，*P ＜0.05；与空白对照相比，△P ＜0.05；与补肾壮骨组相比，#P ＜0.05

组别同源对照组空白对照组补肾壮骨组rhGH 组联合用药组干预3 个月TLM 17.6±1.51 22.6±1.14*26.2±0.84*△25.6±1.95*△26.4±1.14*△TFM 7.4±1.52 6.2±1.30 4.2±0.84*3.2±0.84*△3.4±0.55*△FM（%）29.86±4.75 20.82±2.95*13.72±2.44△10.82±2.12△11.26±1.27△干预6 个月TLM 17.4±1.14 20.4±0.90*24.0±2.00*△24.2±1.92*△23.6±0.89*△TFM 8.2±1.30 9.6±1.52 6.8±0.84△5.6±0.90*△6.0±1.00△FM（%）31.34±4.30 31.20±2.92 21.34±1.67△18.74±1.87△19.48±2.40△

2.3 骨密度和骨矿含量比较BMD 比较：（1）两阶段干预后，同源对照组均较空白对照组（P＜0.05）；（2）3 个月干预后，与空白对照组比较，rhGH组及联合用药组未见明显变化（P＞0.05），补肾壮骨组有所上升（P＜0.05）；（3）6 个月干预组后，与空白对照组比较，rhGH 组、补肾壮骨组及联合用药组均有上升（P＜0.05），3 组药物干预组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

BMC 比较：（1）两阶段干预后，同源对照组均比空白对照组高（均P＜0.05）；（2）与空白对照组相比较，rhGH 组及联合用药组未见明显变化（P＞0.05），补肾壮骨组有所上升（P＜0.05）；补肾壮骨组高于rhGH 组及联合用药组（P＜0.05）；（3）6 个月干预后，与空白对照组相比较，rhGH组、补肾壮骨及联合用药组均有所上升（P＜0.05）；补肾壮骨组高于rhGH 组及联合用药组（P＜0.05）。见表5。

表5 各组BMD 及BMC 比较Tab.5 Comparison of BMD and BMC in each group ±s

注：与同源对照组组相比，*P ＜0.05；与空白对照相比，△P ＜0.05，与补肾壮骨相比，#P ＜0.05

组别同源对照组空白对照组补肾壮骨组rhGH 组联合用药组干预3 个月BMD（g/cm2）0.070±0.004 0.064±0.002*0.069±0.002△0.062±0.003*#0.066±0.004 BMC（g）0.598±0.013 0.534±0.030*0.634±0.050△0.542±0.008#0.566±0.034#干预6 个月BMD（g/cm2）0.071±0.003 0.061±0.001*0.072±0.004△0.070±0.002△0.071±0.002△BMC（g）0.600±0.049 0.510±0.039*0.702±0.029*△0.592±0.033△#0.606±0.050△#

各药物干预组小鼠的BMD 和BMC 组间比较经析因设计的方差分析处理：总的校正模型差异均有统计学意义（均P＜0.05），干预3个月及6个月后，补肾壮骨组与rhGH 组间对小鼠BMC 的影响均存在负交互作用（F= 6.265，26.536，均P＜0.05）。干预3 个月后，补肾壮骨颗粒与rhGH 对小鼠BMD的影响不存在交互作用（F= 0.441，P= 0.516）。干预6 个月后，补肾壮骨颗粒与rhGH 对小鼠BMD的影响存在负交互作用。见表6 和图2。

表6 BMD 及BMC 的析因方差分析Tab.6 Factorial design analysis of variance of BMD and BMC

3 讨论

老年性骨质疏松症的出现与多种因素相关，随着年龄的增长而逐渐降低的GH 是其中的一个重要原因。伴随着GH 下降，肌肉含量减少及脂肪组织增加［8］，从而导致机体活动功能减退，最终出现老年性骨质疏松。有研究发现对成人GH 缺乏患者采用rhGH 替代治疗可增加瘦体质量、降低脂肪含量、增加脊柱BMD 及提高等距屈膝力量，另外可阻止由正常老化导致的肌肉性能和神经肌肉功能减退［9-12］。但也有研究发现成年人GH 替代治疗可以延缓肌肉力量的下降，运动能力未发现提高［13-14］，这可能除了肌肉本身的影响外，关节运动功能的好坏和神经信号的强弱也与活动能力有关。血清IGF-1 浓度与BMD、BMC、脂肪含量和瘦体质量呈正相关［15］，肌肉特定部位的IGF-1 表达可提高肌肉的再生能力和防治肌纤维化［16］。可见，GH/IGF-1 轴本身除了直接影响成骨细胞及破骨细胞外［17］，还可能影响体质成分进而间接对BMD 产生影响。团队前期研究发现补肾壮骨颗粒对快速老化雄性小鼠BMD 的影响可能通过调节GH/IGF-1轴的功能实现，因此，笔者猜想补肾壮骨颗粒提高BMD 的作用与rhGH 替代治疗相似，同样对体质成分有影响。因此，本研究试图从调节体质成分方面进一步比较二者的作用，为在骨质疏松症治疗中以补肾壮骨颗粒替代rhGH 提供更多的依据。

图2 两种药物对BMC 和BMD 影响的交互作用示意图Fig.2 Factorial design analysis of variance of BMD and BMC

快速老化小鼠SAM（Senescence accelerated mouse），是日本京都大学培育繁殖的快速老化动物模型，分为两个品系：一为正常老化的R 品系，二为快速老化的P 品系。R 品系的各项老化速度、生理指标和正常小鼠类似，而SAMR1 通常被用作正常老化对照组。P品系老化速度加快，在4 ～6个月龄时就已经迅速出现老化病理现象［18］。其中SAMP6 是唯一一种已经被证实可随年龄增长出现脆性骨折的动物模型［19］，常被用为老年性骨质疏松动物模型。本研究发现同源对照组小鼠的BMD较P6 空白对照组小鼠高，采用P6 小鼠作为老年性骨质疏松模型进行本实验研究，具有一定意义。

骨质疏松属于中医“骨枯”、“骨萎”、“骨痹”和“腰背痛”等范围，致病因素多为肾虚、脾虚、肝郁、血瘀。在老年性骨质疏松的发病过程中，骨质疏松症主要病机为脾肾两虚，肝郁血瘀。补肾壮骨颗粒是邓伟民教授治疗骨质疏松症的验方，此方正是针对这些病因病机，从补肾健脾和化瘀方面着手治疗。近年临床研究发现补肾壮骨颗粒在老年男性骨质疏松症患者的治疗中疗效确切，可改善骨代谢、增加BMD、降低骨折率及缓解骨痛［20-22］。本研究发现，干预3 个月及6 个月后，补肾壮骨颗粒干预组BMD 均有提高，再次验证了补肾壮骨颗粒治疗老年男性骨质疏松症的疗效。

本实验发现干预3 个月后，3 组药物干预组TLM 提高及FM 下降，补肾壮骨颗粒组的BMD 及BMC 均有所上升，但rhGH 及联合用药组BMD 和BMC 未见明显变化。干预6 个月时后，3 组药物干预的TFM 及FM（%）均有所下降、TLM 及BMD 和BMC 均有所上升，但补肾壮骨颗粒组的BMC 较rhGH 组及联合用药组高。表明rhGH 替代治疗要获得与补肾壮骨颗粒组同样的BMD 变化需要延长治疗时间，本研究中rhGH 治疗可降低TFM 和增加TLM 及BMD 的结果与前研究一致。从实验结果看，联合用药组和单独用药组未见明显优势，通过析因方差分析发现，补肾壮骨颗粒与rhGH 存在拮抗作用，结合前期研究，考虑两种药物对体质成分的影响均可能通过GH/IGF-1 共同信号通路实现，因此，两种药物在治疗骨质疏松时不宜联合使用。

本研究存在一定的局限性，肌肉对骨的影响主要是通过肌肉收缩的力量及机体的运动能力实现，而本实验中对肌肉的评估主要依靠DXA 进行，未能对肌肉功能如肌肉强度及运动功能进行评估。

综上所述，本研究发现补肾壮骨颗粒可降低TFM 及FM（%）和提高TLM 及BMD，3 个月治疗效果较rhGH 佳，6 个月治疗效果与rhGH 相当。结合前期研究，补肾壮骨颗粒在老年性骨质疏松治疗方面可能可替代rhGH。下一步实验将采取措施对肌肉功能和运动能力进行评估。