培养基加氟后渗透压变化对成釉细胞超微结构影响的观察

张乐 王垚 王军强 曹伟靖 张学武

成釉细胞(ameloblast)是牙釉质形成的关键细胞[1]，来源于牙胚内釉上皮。成釉细胞对氟十分敏感，目前认为过量的氟作用于成釉细胞，可造成细胞的形态结构改变，基质分泌异常，功能障碍，继而引起牙齿的发育和矿化障碍，导致氟牙症的形成。

现阶段获得成釉细胞主要方法来源于体外培养，培养体外细胞的过程中，培养基的渗透压需保持在一定的平衡范围内。如果渗透压发生变化，平衡被打破会造成细胞生物学特性异常。前期，本课题组已成功制备染氟的成釉细胞[2]，由此发现体外染氟成釉细胞的一系列生物学特性发生变化。为明确这种变化的真正原因，我们在前期实验中初步发现加入氟化钠、氯化钠等渗透压调节剂后可使培养基的渗透压发生变化，这种变化对成釉细胞的形态方面未见明显影响[3]。本研究将继续通过观察成釉细胞于不同环境中的超微结构，明晰渗透压对成釉细胞生物学特性的是否有影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与仪器

健康的出生4 d的SD大鼠(西安交通大学实验动物中心)；透射电子显微镜(H-7650*，日本);全自动冰点渗透压仪(ONE-TEN OSMOMETER，德国);50 mOsm/kg 和850 mOsm/kg 氯化钠标准定标液、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaOH、Na2EDTA·2H2O、溴酚兰、二甲苯(西安化学试剂厂);醋酸(天津市河东区红岩试剂厂);胶原酶、胰酶、明胶(Sigma公司，美国);DMEM(Hyclone公司,美国);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);甘油(西安交通大学法医实验室惠赠)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验组设置 通过本课题组前期预实验和查阅文献资料[2-3]，实验选取0 mg/L氟化钠，42 mg/L氟化钠，84 mg/L 氟化钠3 组。为观察对比成釉细胞超微结构变化情况，通过查阅文献资料[4]和预实验的结果：分别选取58.5 mg/L(1 mmol/L,324 Pa)氯化钠、117 mg/L(2 mmol/L,329.2 Pa)氯化钠、0.05 mg/L甘油(324.3 Pa)、0.09 mg/L甘油为42 mg/L(1 mmol/L,330.1 Pa)和84 mg/L(2 mmol/L,330.8 Pa)氟化钠组的对照组[4]。

1.2.2 成釉细胞的体外培养 沿用本课题组已建立的体外培养成釉细胞方法[5-6]：取断颈处死四天龄的SD大鼠，用75%的酒精浸泡头部15 min后分离下颌骨，仔细剥离双侧下颌内磨牙牙胚将其置于培养皿内，PBS清洗两遍，加入0.25%的 Ⅰ型胶原酶，轻柔剪碎牙胚，使其成d≤1 mm的组织块，然后置于37 ℃恒温孵育箱内消化2 h。取出培养皿，放入超净台，静置2 min，吸出上层消化液，弃之，PBS清洗，再加入新配置的0.25%胰酶，消化8 min，终止消化，静置1 min，收集上清，放置于离心管，1 200 r/min离心3 min，弃去上清，将已配置好的含10%胎牛血清的DMEM培养液加入，吹打混悬并均分，分别将其接种于已用明胶包被完成的培养瓶中。

1.2.3 分别于2、4 d时差别消化。5 d后，观察待成釉细胞进入生长期、且纯度达到可以电镜下检查的要求后，7 组实验组分别加入含氟化钠 0 mg/L(空白对照组)、42 mg/L、84 mg/L、氯化钠 58.5mg/L、117 mg/L、甘油0.05 mg/L、0.09 mg/L的培养基。

1.2.4 48 h后 ①新鲜配制的0.25%的胰酶消化细胞，1 200 r/min，3 min离心收集细胞，戊二醛固定细胞；②细胞团块移入容器中，4 ℃ PBS漂洗3 次×10 min。4 ℃ 1% 四氧化锇固定15 min，PBS漂洗3 次；③室温下于系列丙酮脱水(每次10 min)：50%丙酮1 次,70%丙酮1 次,90%丙酮2 次,纯丙酮3 次；④浸透：吸弃脱水剂，加包埋剂，静置30 min，除去包埋剂，加纯包埋剂1 ml，隔夜保存；⑤包埋：用混合包埋剂将成釉细胞团块注满，于烤箱烘烤，固化成硬块；⑥修块：包埋块装在夹具上，显微镜下，修块；⑦切片：先将包埋块切成厚约1 μm的半薄切片，染色后镜下观察成釉细胞图像，确定部位位置，作好标记，切厚约60 nm的超薄切片，挑片，贴在铜网上；⑧电子染色：行柠檬酸铅的染色和清洗。凉干观察。

2 结 果

本研究使用透射电子显微镜观察各组成釉细胞超微结构，结果显示：对照组(图1)成釉细胞胞体呈椭圆状，胞体表面有微绒毛，细胞核亦呈现不规则长圆形，大都居于中央，可见1～2 个清晰核仁，核仁大而明显，核周围胞浆内有可见充足的内质网，高尔基体，也可见线粒体和游离的核糖体，含蛋白质分泌物，空泡和脂滴，还有清晰的属上皮细胞的张力原纤维，其中内质网大都无明显变化，仅个别内质网轻度扩张；42 mg/L (1 mmol/L)氟化钠组(图1中F1)成釉细胞大多体积变小，细胞连接较松散，个别细胞水肿，并有死细胞出现，细胞核皱缩，部分粗面内质网扩张，高尔基体水肿，其余细胞器无明显变化，张力原纤维稀疏；84 mg/L(2 mmol/L) 氟化钠组(图1中F2)成釉细胞膜溶解破坏，细胞核溶解，胞浆，细胞器溢出，大部分明显肿胀，可见空泡性变。117 mg/L(2 mmol/L)氯化钠组(图2)，0.09 mg/L甘油组(图3)成釉细胞超微结构与对照组大致相同。张力原纤维溶解模糊(图4)，界不清，染色体出现凝集，边集现象(图4)，细胞核碎裂后向包膜边缘扩散，或可形成凋亡小体(图4)，被溶酶体吞噬，外排。线粒体极度水肿(图4)，嵴崩解消散，结构模糊。

3 讨 论

近年来，国内外学者从多方面对氟牙症进行研究，普遍认为氟化物可以引起成釉细胞增殖、凋亡及蛋白分泌的一系列变化，但具体机制尚不清楚[7-8]。为直观发现氟对体外培养成釉细胞的影响情况，本课题组前期在培养成釉细胞的培养基中加入不同浓度的氟化钠后发现氟离子的添加，成釉细胞的形态结构，增殖凋亡均发生了变化的同时考虑到氟离子的添加会导致培养基渗透压的变化，从而怀疑渗透压的这种改变是否间接干扰了氟对成釉细胞的影响，即体外培养成釉细胞细胞形态功能的变化是由于氟离子的直接毒性作用，还是由于氟离子导致渗透压的变化，间接影响细胞，有必要进一步研究。

图1 3 组成釉细胞超微结构观察Fig 1 Observation of ameloblast ultrastructure of the 3 groups

图2 117 mg/L氯化钠组(N2)成釉细胞超微结构观察Fig 2 Observation of the ultrastructure of ameloblasts of 117 mg/L sodium chloride group(N2)

图3 0.09 mg/L甘油组(G2)成釉细胞超微结构观察Fig 3 Observation of the ultrastructure of ameloblasts of 0.09 mg/L glycerol group(G2)

图4 84 mg/L氟化钠组成釉细胞超微结构观察Fig 4 Ultrastructure observation of ameloblasts of 84 mg/L sodium fluoride group

细胞的生长和存活受到渗透压十分显著的影响，尤其对于体外培养细胞，渗透压是关键的影响因素[9]。本研究在实验中将氟化物加入培养基，改变了培养基中溶质的总离子浓度，继而可能会影响培养基的渗透压。本课题组前期实验[4]通过冰点渗透压仪检测各实验组渗透压值，各实验组显微镜下及HE染色结果发现渗透压变化对成釉细胞形态无明显影响，染氟成釉细胞形态变化与渗透压的变化无关，而是由氟离子浓度改变所致。本实验通过透射电子显微镜分别继续观察了对照组，42 mg/L和84 mg/L的氟化钠组，117 mg/L 氯化钠组，0.09 mg/L甘油组细胞的超微结构，发现渗透压的改变对成釉细胞的超微结构无明显影响。

细胞膜是细胞的机械性和化学性屏障，同时参与细胞的内外物质交换、运动以及生长调控等；线粒体则是细胞内产生能量的主要场所；粗面内质网参与了细胞蛋白质的合成[10]；高尔基体与细胞的分泌活动和溶酶体的形成有关；而来源于上皮细胞的张力原纤维[11]，是上皮角蛋白中间丝，它们呈连于桥粒的致密束状。在细胞连接处能加固细胞间的连接，在细胞内起支持，保持细胞韧性和弹性的作用。近年来研究发现[12]：氟化钠会引起原代成釉细胞超微结构的变化。过量的氟化物作用于原代成釉细胞，首先会引起内质网应激,进而导致非折叠蛋白反应[13]。

本研究于电镜下发现：与对照组相比，42 mg/L 氟化钠组细胞大多体积变小，细胞连接较松散，部分粗面内质网扩张，高尔基体水肿，张力原纤维稀疏；84 mg/L 氟化钠组细胞膜溶解破坏，细胞核溶解，胞浆，细胞器溢出，内质网疏松形成空泡，线粒体肿胀嵴消失，张力原纤维溶解模糊，与其他文献研究[14-15]结果相同。而与之渗透压相同的117 mg/L 氯化钠 0.09 mg/L甘油各组细胞超微结构均与对照组相似，并未出现明显变化。根据上述变化可以推测：体外培养成釉细胞，培养基中随着氟浓度的增加，成釉细胞的超微结构变化更明显。成釉细胞超微结构的变化主要是由于氟的毒性作用。本课题组将对染氟成釉细胞生物学特性继续进一步的研究。