从分子生物学角度对成釉细胞瘤诊断及治疗的考量

钱颖 龚佳幸 俞梦飞 刘宇 魏栋 朱子羽 陆科杰 王慧明

1.浙江大学医学院附属口腔医院口腔种植中心 浙江大学口腔医学院浙江省口腔生物医学研究重点实验室 杭州 310006；2.浙江大学医学院附属第一医院口腔颌面外科 杭州 310006

成釉细胞瘤是一种生长缓慢，具有局部侵袭性，不具有远处转移能力的牙源性肿瘤，多发生于成年人。尽管有许多关于成釉细胞瘤发病机制的假说，但目前病因尚未完全明确。基因表达谱分析显示：成釉细胞瘤受有丝分裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信号通路[1-2]、Sonic Hedgehog（SHH）信号通路[3]和经典WNT/β-catenin信号通路[4]的调控。还有研究[5]发现：成釉细胞瘤的许多分子标志物具有不同的生物学作用，可能与分类、治疗及预后相关。目前，成釉细胞瘤常规的治疗方法是手术切除，若切除不充分或行保守治疗，该病极易复发。故治疗该病的标准方法为肿瘤边缘至少5 mm切除[6]。然而，成釉细胞瘤因生长缓慢，发现时肿瘤体积通常较大，行切除术后往往会导致面部畸形，造成口腔颌面部功能损害，进而影响患者身心健康[1,7]。因此，早发现、早诊断以及寻找到新型治疗方法显得尤为重要。

近来，部分学者关注并发现了成釉细胞瘤分子层面的一些特征，有研究[3,8-9]报道：成釉细胞瘤中鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1， BRAF）激活突变的频率高达50%~60%，对于多次复发或不适合手术治疗的患者，针对这种突变的靶向治疗已经成为一种替代治疗。有研究者[10]发现：成釉细胞瘤的复发风险与突变状态有关，且靶向治疗作为辅助或新辅助治疗，可以改善预后。新辅助治疗是指在手术治疗前给予的治疗措施，包括化学治疗、放射治疗及放射和化学治疗。

本文就成釉细胞瘤的分类、分子水平标志物、发病机制、靶向治疗及预后进行综述，从而更好地了解这一肿瘤的生物学行为，旨在为临床治疗提供一定依据，并提高临床治愈率。

1 成釉细胞瘤的分类

根据成釉细胞瘤临床和影像学特征，2005年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）标准[11]将其分为实性/多囊型、外周型、促结缔组织增生型和单囊型，其中以实性/多囊型最为常见。

2017年，WHO[12]依据成釉细胞瘤的临床特点进一步简化分为3型，即经典型、外周型和单囊型。实性/多囊型以及促结缔组织增生型因临床表现、治疗方案和预后相似而被统称为经典型成釉细胞瘤。

大量研究[3,9-10]显示：成釉细胞瘤的突变基因型与组织学分型相关。

不同突变基因型的成釉细胞瘤具有不同的组织学特征、肿瘤学行为和临床特征，对相对应的分子靶向治疗有特定反应。如：实性/多囊型成釉细胞瘤中BRAF和Smoothened（SMO）基因突变可同时出现；外周型成釉细胞瘤中出现BRAF或SMO突变；而单囊型成釉细胞瘤中可见BRAF突变，但没有SMO突变[3]。并且多基因突变仅存在于实性/多囊型成釉细胞瘤中。成釉细胞瘤患者的组织学亚型以滤泡和丛状亚型较为多见，有研究[3,9]显示：大多数滤泡亚型显示BRAF或多基因突变，而大多数丛状亚型则含有SMO、大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物（rat sarcoma viral oncogene homolog，RAS）突变。因此，笔者认为突变状态可能与组织学亚型有关。

2 成釉细胞瘤的标志物

已有相关研究发现成釉细胞瘤有许多特异性或非特异性分子标志物，可能与分类、治疗及预后相关。

目前，成釉细胞瘤的标志物可分为4类[13-26]：第1类主要用于跟踪和鉴定细胞表面和细胞内的变化，包括细胞外基质降解、黏附、迁移、分化、自噬和凋亡等生物学行为；第2类用于检测成釉细胞瘤的增殖特性；第3类用于检测成釉细胞瘤内有无血管生成；第4类用于识别成釉细胞瘤的致癌作用。这4类成釉细胞瘤标志物的分类及其具体特点详见表1[13-26]。

表1 成釉细胞瘤标志物的分类及特点Tab 1 Classification and characteristics of ameloblastoma markers

3 成釉细胞瘤的发病机制

目前，成釉细胞瘤的发病机制尚未得到统一论断，近几年有关成釉细胞瘤发病机制的研究报道愈发增多，对其分子和遗传方面的研究也愈发透彻。成釉细胞瘤与MAPK信号通路[1-2]、SHH信号通路[3]和WNT/β-catenin信号通路[4]相关的多个基因的失调密切相关。这些信号通路中往往有高度重复的体细胞基因突变，而这些基因突变将导致信号分子结构性激活，进而调节肿瘤细胞的存活、凋亡和增殖[2-3,9]。

MAPK信号通路相关的基因突变是其中一种复杂的致病因素。成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2） 和上皮细胞生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通过激活下游的RAS、RAF、MEK和细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinases，ERK），从而激活该级联反应，然后诱导部分上皮细胞的增殖、迁移、侵袭和分化等细胞过程[8,27]。MAPK途径中最常见的体细胞突变是BRAF基因突变。BRAF是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞代谢和增殖。BRAF基因突变中最常见的是BRAF 密码子600 处的缬氨酸被谷氨酸（V600E）取代[1,10]，导致MEK/ERK信号的结构性激活，进而导致转录因子的激活，促进肿瘤细胞增殖、存活[28-29]。该突变参与成釉细胞瘤的发生发展，也可参与其他组织的肿瘤发生，如黑色素瘤、结直肠癌等[30]。MAPK通路中的其他突变也可导致成釉细胞瘤的发生，包括RAS突变和FGFR2突变，但发生率较低。RAS是一种信号转导蛋白，通过介导细胞对细胞外刺激的反应，参与许多重要的细胞过程，如细胞增殖、分化和存活等[31]。RAS基因包括Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物 （Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、神经母细胞瘤RAS病毒致癌基因同源物（neuroblastoma RAS vrial oncogene homolog，NRAS）和Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物（Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS），是人类肿瘤常见的突变基因，其中以KRAS突变最为常见。有研究[32-33]显示：KRAS突变与复发相关，相较于其他RAS基因突变死亡风险更高，故检测KRAS突变对多种肿瘤的预后和治疗具有重要的临床意义，可用于评估患者预后及指导辅助治疗方案。FGFR2则是激活RAS的受体之一。FGFR2突变在成釉细胞瘤中的发生率为6%~18%[9,28]，常出现在受体的跨膜或激酶结构域处。RAS和FGFR2突变都将导致MAPK途径激活并诱导细胞增殖、分化和凋亡等。因而，以上每一种突变都通过MAPK信号通路在成釉细胞瘤发病的过程中发挥作用。

SHH信号通路在人类组织的形成中起着重要作用，如神经系统、胃肠系统、肺和牙齿等，其主要功能是通过激活参与细胞增殖和凋亡的基因转录，以协调胚胎组织和间充质的生长。研究[3,18,28,33-34]显示：SHH信号通路的异常激活与成釉细胞瘤的发生有关。在发育的牙胚中，SHH在上皮成分中表达，并调节成釉细胞的增殖和分化，该通路的紊乱被认为是成釉细胞瘤发病的潜在因素。SHH是Hedgehog基因编码的一种分泌性蛋白，它能激活由Patched 1（PTCH1）和SMO形成的膜受体复合物[14,33]。SMO蛋白是一种非经典的G蛋白偶联受体，是SHH信号通路必需的跨膜信号转导成分。在静息状态下SMO被PTCH1抑制，进而抑制下游基因的表达。当有SHH信号时，SMO蛋白不再被PTCH1抑制，而与Hedgehog配体结合并激活胶质瘤（glioma，GLI）转录因子家族，包括GLI1、GLI2和GLI3，触发SHH通路[14,34-35]。GLI蛋白介导SHH信号从细胞质转导到细胞核，并作为转录因子激活Hedgehog依赖的靶基因。有研究[8,10]显示：SMO突变在成釉细胞瘤中的发生率仅次于BRAF突变，其突变可导致SHH信号通路的结构性激活，有利于细胞的存活和增殖，并且往往与BRAF突变相互排斥。SMO的上调激活多种恶性肿瘤相关的信号通路，可能引起牙源性上皮的癌变和侵袭。

WNT信号通路分β-catenin依赖的经典WNT/βcatenin和非经典通路（与β-catenin无关）。有研究[36]显示：在成釉细胞瘤中经典WNT配体蛋白表达增加，非经典WNT配体蛋白极少表达，提示WNT/β-catenin信号通路是成釉细胞瘤发生的主要通路。WNT/β-catenin信号通路对细胞增殖、迁移、凋亡等多种细胞过程的调控具有重要作用，从而影响成釉细胞瘤的生物学行为。在各种经典WNT配体中，以WNT-1最为常见，其是一种调节细胞间黏附的信号分子，通过发挥抗凋亡作用促进肿瘤发生，可能是成釉细胞瘤进展和预后的潜在指标。CTNNB1基因编码的β-catenin是WNT/βcatenin信号通路中的一个关键因子，起转录激活作用。WNT/β-catenin信号通路由WNT配体与低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LRP）-5/6和Frizzled受体结合而触发，这抑制糖原合成酶激酶-3β （glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的活性，从而使β-catenin无法磷酸化并使其在细胞核中聚积，激活WNT靶基因表达[20,36-37]（图1）。

图1 成釉细胞瘤相关信号通路及靶向治疗药物Fig 1 Signal pathways and targeted therapeutic drugs associated with ameloblastoma

综上所述，MAPK信号通路、SHH信号通路和WNT/β-catenin信号通路在成釉细胞瘤的发生中具有重要作用。其中，MAPK信号通路的FGFR2-RAS-BRAF突变和SHH信号通路中的SMO突变是大多数成釉细胞瘤发病的关键突变。在不含成釉细胞上皮的牙源性肿瘤中，没有发现最常见的BRAF V600E突变，这表明BRAF V600E可能是成釉细胞瘤的一个诊断标志物[28]。成釉细胞瘤的分子特征与组织学评估、临床特征及预后有关。携带BRAF突变的成釉细胞瘤多见于下颌骨和年轻患者，而SMO突变更多地发生在老年患者的上颌成釉细胞瘤中，并表现为早期复发，但关于BRAF及SMO突变与肿瘤位置及发病年龄之间的关系，尚待进一步的研究证明[2-3,8-10,26]。

4 成釉细胞瘤的靶向治疗

成釉细胞瘤的治疗方法虽然在一定程度上结合了肿瘤类型、临床表现、组织学特征等相关因素，但方式仍然较为单一，主要是外科治疗，包括根治性手术和保守治疗。根治性手术[6,38-39]是指肿瘤边缘至少5 mm的切除术或病变的节段切除术，对于较大的成釉细胞瘤同期重建恢复连续性。根治性手术的复发率低，是目前临床应用最为广泛的治疗方案。然而，不同类型成釉细胞瘤的生物学行为不同，故切除范围也有较大争议。但切除手术均会影响患者颜面部的美观与功能，因此在选择手术方案时，应考虑患者的身体状况、肿瘤的大小和位置、可能的并发症、功能恢复和美观程度、术后生活质量、术后复发率、病死率，根据具体情况制定最适合该患者的个性化诊疗方案。此外，儿童作为特殊患者，需更谨慎并以发展的眼光考虑手术对生长发育及心理情况的影响。经过多年的临床治疗发现，成釉细胞瘤恶变情况甚少，故有学者主张采用保守治疗。保守治疗[1,38-39]包括去核、剜除、烧灼、刮除以及开窗减压等，因其保留了患者的正常组织，最大限度地减少了面部畸形，降低了颌骨骨折概率，故患者术后生活质量较高，但是术后复发率也较高。随着对成釉细胞瘤分子生物学层面作用机制研究的愈发透彻，靶向治疗已经成为成釉细胞瘤的新型治疗方案。

成釉细胞瘤靶向治疗的发展与其发病机制相关的分子信号通路的新进展相关。目前，已有研究[3,8-9]分析发现：成釉细胞瘤患者中80%~90%发生了体细胞基因突变，其中，50%~60%发生BRAF V600E突变，其次是SMO突变（15%~30%）。这一发现提示了对成釉细胞瘤患者进行靶向治疗的可能性。前文已经叙述成釉细胞瘤的发病机制主要是激活了MAPK信号通路、SHH信号通路和WNT/β-catenin信号通路，故选择合适的干扰肿瘤发生和进展的靶向药显得尤为重要。通过测序识别肿瘤基因突变来确定分子亚型，可为指导成釉细胞瘤的分子靶向治疗提供依据。

BRAF突变、RAS突变和FGFR2突变均可激活MAPK信号通路，进而诱导细胞增殖，而这种作用可被BRAF抑制剂、MEK抑制剂以及FGFR2抑制剂所阻断（图1）。美国食品和药物管理局[9]批准了3种抑制MAPK信号通路的分子靶向药，即抑制BRAF突变的维罗非尼和达拉非尼，抑制MEK突变的曲美替尼。而对抑制FGFR2突变的靶向药，如普纳替尼的研究尚不足。

Fernandes等[8]报告了1例29岁女性复发性成釉细胞瘤，她在20年多的时间里因反复复发，接受了多次外科手术，并发现了BRAF V600E突变。接受维罗非尼治疗11个月后，肿瘤体积缩小，患者无严重不良反应。Tan等[40]报道了1例85岁的成釉细胞瘤患者，他在发现下颌骨病变4个月后出现病区的病理性骨折。经遗传分析显示存在BRAF基因突变，他选择用达拉非尼进行治疗。治疗10周后，影像学提示肿瘤体积变化轻微；在16周后，肿瘤体积减少了90%。相比于其他恶性肿瘤，成釉细胞瘤对靶向治疗的突变反应较低。这种异常的反应动力学可能与成釉细胞瘤的2个特点有关，包括成釉细胞瘤的增殖能力相对较弱及该肿瘤基因的突变概率较普通癌症低。BRAF抑制剂对成釉细胞瘤的持续抑制作用反映了成釉细胞瘤基因组的均一性以及较低的其他突变，使肿瘤细胞无法逃避BRAF抑制剂的影响。因此，单一BRAF抑制剂可显著减小复发性成釉细胞瘤的体积，从而改善面部畸形。

虽然已有靶向治疗成釉细胞瘤成功的病例报道，但仍存在许多挑战，如在靶向治疗的过程中往往会获得耐药性并产生一定程度不良反应[2]，甚至某些单独使用BRAF抑制剂治疗的患者竟发展成为鳞状细胞癌[41]。有研究[2,42]显示：联合使用BRAF抑制剂和MEK抑制剂治疗成釉细胞瘤可以克服以上问题。Brunet等[42]报告了1例26岁女性转移性成釉细胞瘤的病例。肿瘤的分子筛查显示BRAF V600E突变。患者开始用达拉非尼和曲美替尼联合治疗，治疗30周后仍有持续肿瘤缩小反应，表明联合BRAF抑制剂和MEK抑制剂可解决单一应用BRAF抑制剂的局限性，显著延迟耐药性出现的时间。此外，联合治疗的药物毒性较低，最常见的不良反应为皮疹、发热、虚弱、头痛、恶心和关节痛[43]。

目前，SHH信号通路的抑制剂研发也是成釉细胞瘤靶向治疗的新兴领域。其中，SMO抑制剂较为多见，包括环胺、维莫德吉和伊曲康唑等（图1）。环胺是一种植物源性生物碱，通过抑制SMO，阻断SHH信号通路反应性激活和细胞异常生长，从而有效地降低癌细胞的生存能力。有研究[19,44]显示：环胺对乳腺癌、胰腺癌、髓母细胞瘤和口腔鳞状细胞癌细胞有一定抑制作用。然而，环胺在抑制成釉细胞瘤细胞增殖的同时，也抑制成骨细胞增殖和分化[1]，这可能不利于成釉细胞瘤患者的术后恢复[45]。维莫德吉是一种直接与SMO结合的SMO抑制剂，已被批准用于基底细胞癌的治疗[35,37]，但使用SMO抑制剂进行成釉细胞瘤靶向治疗会产生耐药性SMO突变体[46]。伊曲康唑和三氧化二砷是美国食品和药物管理局批准的SHH通路抑制剂，三氧化二砷可通过抑制GLI蛋白抑制SHH信号。伊曲康唑虽也是SMO抑制剂，但其作用部位不同于环胺类药物。故单一或联合使用伊曲康唑和三氧化二砷对出现耐药性SMO突变体的肿瘤具有一定抑制作用[46]。此外，伊曲康唑和三氧化二砷联合治疗可在维持甚至提高抗肿瘤疗效的同时降低药物使用剂量，并降低不良反应[19,44]。SHH抑制剂还包括KAAD环胺、Robotnikinin、介芬胺、IPI-926、JK184和GANT61等，这些药物在成釉细胞瘤靶向治疗中的作用尚需进一步研究，以期降低手术发病率，改善预后。

目前，有关WNT/β-catenin信号通路抑制剂在成釉细胞瘤中应用的报道极少，有待进一步的研究。

综上所述，MAPK和SHH信号通路相关的抑制剂治疗成釉细胞瘤的应用前景较好，尽管目前尚没有大量的临床试验显示成釉细胞瘤靶向治疗的成功，但其可被用作辅助或新辅助治疗，以改善治疗结果，增加功能活动性，并改善患者颜面部美观。

5 成釉细胞瘤的预后及复发

成釉细胞瘤相对较高的复发率受分子病因类型、治疗方法和患者就诊的早期程度影响。成釉细胞瘤的分子生物学特点除与表型相关，也可能与预后相关，进一步阐明成釉细胞瘤发病和复发相关的分子因素，有望为成釉细胞瘤的诊断和靶向药物治疗提供新的依据。有学者[28]认为BRAF和其他非SMO基因突变的患者预后可能更好。SMO基因突变的成釉细胞瘤患者多发生于老年患者的上颌骨[3]，发现时往往累及上颌窦、眼眶等重要结构，且处于肿瘤后期，故预后较差。根据成釉细胞瘤的分子亚型，其复发风险与突变状态之间有明显的相关性。多基因突变的成釉细胞瘤复发率最高，SMO基因突变的肿瘤复发风险次之，BRAF基因突变的肿瘤复发风险显著降低[2-3,9]。当然，治疗方式也与复发风险息息相关。与保守治疗方法相比，根治术后成釉细胞瘤的复发风险较低。实性/多囊型与单囊型成釉细胞瘤相比，无论是保守治疗还是根治手术，其合并复发率均较高[47]。这可能表明实性/多囊型成釉细胞瘤的生物学行为比单囊型更具侵略性。因此，成釉细胞瘤的治疗，特别是实性/多囊型的治疗，应包括有足够边缘的节段切除。

6 总结和展望

由于成釉细胞瘤的发病机制复杂，多种信号通路之间存在重叠和干扰，其发病机制目前尚未完全明确。对成釉细胞瘤的一系列研究表明：成釉细胞瘤的分子特点与类型、靶向治疗、预后及复发存在密切联系，其中，MAPK、SHH和WNT/β-catenin信号通路在预防、诊断或治疗成釉细胞瘤中起到至关重要的作用。根治性手术能最大限度地减少复发，是治疗实性/多囊型成釉细胞瘤的最佳选择。而对于管腔型单囊型成釉细胞瘤来说，可采用保守治疗，以减少手术创伤。

近年来，随着对成釉细胞瘤分子发病机制研究的愈发透彻，靶向治疗的发展有了较大的突破，但它们也具有一定的局限性，如产生了耐药性和一些不良反应。为了获得更好的临床效果，有必要研究新的靶向药用于替代或联合使用。目前，有关BRAF和MEK抑制剂对明确突变基因型的成釉细胞瘤患者疗效显著且不良反应较小，具有较好的临床应用前景。然而，目前BRAF和MEK抑制剂的种类较少，给药方式也较为单一。因此，未来的研究更需要集中在药物研发、替代给药策略、组合疗法及新辅助治疗方式的研发上。若能破解上述难题，未来几年有关成釉细胞瘤的靶向治疗有望取得重大的研究进展。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。