几种茶对大鼠草酸钙结石的影响

罗千旋，刘云龙，刘权，李德荣，孙焱，康珏宁，邓耀良

(广西医科大学第一附属医院 泌尿外科,广西 南宁)

0 引言

茶是世界上最受欢迎的饮料之一，按照制造工艺可简单分为两种：不发酵茶和发酵茶；发酵茶按发酵的形式又可以分为前发酵茶和后发酵茶。不发酵茶叶即绿茶，以采摘适宜茶树新梢为原料，不经发酵。发酵茶是指在茶叶制作中有“发酵”这一工序的茶的统称。发酵按其发酵过程中有没有微生物的参与可分为前发酵和后发酵。前发酵是茶叶自身的内源性酶促发酵，后发酵茶则需要微生物参与发酵，不同的茶种其参与发酵的微生物不同，产生的活性物质也不尽相同。后发酵茶为黑茶，其发酵程度达100%。前发酵茶按发酵程度的高低可分为黄茶（微发酵，10%-20%）、白茶（轻发酵，20%-30%）、青茶（半发酵，30%-60%）、红茶（全发酵，80%-90%）。发酵程度不同，茶叶中的活性成分含量也不一样。

泌尿系统结石形成的相关因素有多种，环境因素具有重要的作用，工业化、生活方式的改变、饮食习惯的变化使得泌尿系统结石呈增加趋势。不健康的生活方式是一般人群患病的主要原因，合理健康的行为可防止疾病的发生发展。因此，我们通过饮食方面对肾结石患者的健康行为进行研究。以往的研究发现茶叶的提取物茶多酚可以抑制尿路结石的形成[1,2]，而茶叶本身含有可溶性草酸盐且不同类别茶叶中的茶多酚含量也存在差异，茶是否可以被结石患者很好的饮用尚存在争议。为此，我们选择不发酵的绿茶、半发酵的乌龙茶、后发酵但菌群不同的普洱茶和六堡茶，四者的活性成分差异明显，我们试着通过对比这四种茶叶对尿路结石形成的影响来进一步探讨。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

乙二醇（分析纯）购自成都金山化学试剂有限公司，立顿牌绿茶和乌龙茶、云南普洱茶（熟茶）、广西六堡茶均购自沃尔玛超市，一步法TUNEL 凋亡试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司，钙盐染色液（改良茜素红S 法）、超氧化物歧化酶（SOD）和还原性谷胱甘肽（GSH）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 茶水的制备

2.5%的茶水通过称取25g 茶叶加入到1L 沸水中继续沸腾30min 制备。茶叶泡开后茶多酚等氧化物会在空气中不断氧化而失去作用，为达到理想真实的效果茶水必须当天制备，这虽然很麻烦但却是必不可少的。

1.3 动物模型建立

所有动物由广西医科大学实验动物中心提供，动物的使用遵守动物保护有关条例且各组大鼠均在相同的环境下饲养。将36 只成年雄性大鼠（SPF 级180-200g）适应性喂养一周后随机分成6 组（n=6）：空白组（A 组）、结石诱导组（B 组）、绿茶干预组（C 组）、乌龙茶干预组（D 组）普洱茶干预组（E 组）六堡茶干预组（F组）。A 组大鼠给予正常饮食并自由饮水；B 组给予大鼠2%的乙二醇自由饮用；C、D、E、F 组给予2%乙二醇+2.5%茶水自由饮用，自由饮用不佳则采取灌胃模式。

1.4 茶水中茶多酚含量的测定

取新鲜备好的绿茶、乌龙茶、普洱茶和六堡茶四种茶水送广西壮族自治区分析研究测试研究中心检测茶水中茶多酚和儿茶素类含量（NO: P-WL1801273E）。

1.5 尿液肌酐、钙离子的测定

饲养4 周后通过代谢笼收集大鼠24h 尿液，全自动生化分析仪（Hitachi 7600，Tokyo，Japan）测量尿液肌酐、钙离子含量。

1.6 血清中 CRE 和 BUN 的测定

在研究结束时，在乙醚麻醉下从大鼠的下腔静脉收集血样分离血清。使用全自动生化分析仪（Hitachi 7600，Tokyo，Japan）测定血清肌酐和血尿素氮水平。

1.7 血清 SOD 和 GSH-Px 活性

严格按照试剂盒说明书以比色法测定大鼠血清SOD 和 GSH-Px 活性。

1.8 原位TUNEL 荧光染色试验

根 据 制 造 商 的 说 明 书（Roche，Mannheim，Germany），使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定来评估肾脏的细胞凋亡。

1.9 病理学分析

28 天后，对大鼠实施安乐死，取右肾用4%多聚甲醛固定并包埋在石蜡中。切片进行HE 染色，根据制造商的说明使用改良茜素红S 法来评估晶体沉积和组织学组织损伤。

1.10 统计分析

所有统计分析均使用SPSS 20.0 软件，数据用means±SEM 表示。两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析 (ANNOVA)，组间两两比较采用 LSD 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 茶水中茶多酚的含量

四种茶水茶多酚和儿茶素类含量从高到低依次是绿茶＞乌龙茶＞普洱茶＞六堡茶（图1）。

2.2 各组大鼠肾功能的变化

与 A 组对比，B 组血清 CRE 和 BUN 水平显著增加；与 B 组对比，使用绿茶（C 组）、乌龙茶（D 组）、普洱茶（E 组）、六堡茶（F 组）干预后则 CRE 和 BUN 水平明显降低，见图2。

图1 新鲜泡好的的绿茶，乌龙茶，普洱茶和六堡茶的茶多酚和儿茶素类含量。

图2 各组大鼠肾功能的变化

2.3 各组大鼠血清SOD 和GSH-Px 活性

与A 组对比，B 组血清SOD 和GSH-Px 活性显著降低；与 B 组对比，使用绿茶（C 组）、乌龙茶（D 组）、普洱茶（E 组）、六堡茶（F 组）干预后则 SOD 和 GSH-Px活性明显提高，见图3。

图3 各组大鼠血清SOD和GSH-Px活性

2.4 细胞凋亡检测

评估茶对肾结石模型大鼠肾小管细胞死亡的影响。与对照组相比，结石模型组TUNEL 阳性细胞数明显增加；而与结石模型组相比，使用绿茶（C 组）、乌龙茶（D 组）、普洱茶（E 组）、六堡茶（F 组）干预后的各组TUNEL 阳性细胞数明显减少，见图4。

2.5 肾脏晶体沉积和组织病理学分析

用肾组织HE 染色和钙盐染色评估CaOx 晶体沉积和肾组织中的病理变化。如图5，与A 组相比， B、C、D、E、F 组的肾组织有所改变，且B 组变化最明显：肾小管管腔扩张、空泡化,上皮细胞损伤脱落。与A 相比，B 组中CaOx 晶体形成显着增加,从皮质区到髓质区都有，而使用绿茶（C 组）、乌龙茶（D 组）、普洱茶（E 组）、六堡茶（F 组）干预后的各组结石晶体明显减少。

图4 细胞凋亡检测

图5 肾组织HE 和钙盐染色（×400）

3 讨论

肾结石是一种严重影响人类健康的常见病和多发病，含钙结石最常见，总发病率为84.1%，肾内常见的晶体主要包括CaOx 晶体、磷酸钙晶体和尿酸盐等成份，其中CaOx 晶体最为常见[3]高草酸饮食是形成泌尿系结石的主要原因，茶叶中含有大量的可溶性草酸盐[4]，可以促进肾结石的形成。

我们先前的研究表明，细胞晶体反应诱导的肾脏炎症损伤在肾内钙草酸盐晶体的形成中起重要作用。暴露于高浓度草酸或草酸钙晶体的肾小管上皮细胞会产生ROS，继而启动氧化应激反应并产生大量的氧自由基，最终介导肾小管上皮细胞的损伤，导致炎症发生[5]。同时，ROS 介导的自噬可能加重肾损伤并促进结石的形成[6]。线粒体通常是ROS 最常见的细胞内来源，细胞损伤通常伴随着ROS 的产生[7]。

儿茶素是绿茶中的主要多酚化合物，儿茶素具有高效的抗氧化活性，尽管在某些情况下它们可能作为促氧化剂在细胞中起作用。儿茶素类是活性氧（ROS）清除剂和金属离子螯合剂，而它们的间接抗氧化活性包括诱导抗氧化酶，抑制促氧化酶，以及产生II 期解毒酶和抗氧化酶[8]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），表没食子儿茶素（EGC），表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表儿茶素（EC）是从绿茶中分离的四种主要天然多酚。EGCG 是最丰富的多酚，占绿茶总儿茶素的38-40%[9,10]。EGCG 具有多种生物活性，包括抗氧化[11-13]，抗炎症[14,15]，抗增殖[16]，抗菌[17]，抗突变和抗癌[18]、清除有毒反应性代谢废物[19]。已知EGCG 是线粒体靶向药物[20-22]。由于强大的抗氧化作用，饮食中衍生的EGCG 可以显著减少线粒体产生的ROS，从而改善心血管疾病的情况[22]。研究表明EGCG 可以抑制泌尿系结石的形成[1]。

随着发酵过程的不断进展，茶叶中一些儿茶素结合形成结构更复杂的茶黄素、茶红素、茶褐素三种茶色素和其他类黄酮，引入不同微生物发酵的后发酵茶更是额外形成了其独特的物质，这些成分给发酵茶添加别致风味的同时也具备了一些特别的生物活性。研究表明茶色素具有抗氧化、抗炎、抗癌抗肿瘤、抗菌抗病毒、降血脂预防心脑血管疾病等作用[23-27]。此外普洱茶（熟）在减轻慢性炎症改善动脉粥样硬化进展方面有所报道[28]，更有报道指出普洱茶（熟）能显著降低高尿酸血症小鼠得血清尿酸水平[29]。一些学者认为茶色素由于具备了更多的活性羟基官能团，在某些方面其药理作用要比儿茶素活跃[30]。我们有理由相信，发酵茶和绿茶一样在预防泌尿系肾结石方面也应具有积极的意义。

在本研究中我们发现，茶叶随着发酵程度的加深茶多酚及儿茶素类含量相应减少，但他们在大鼠草酸钙肾结石模型中效果是相似的。和结石组相比使用4种茶水干预后大鼠血清CRE 和BUN 水平明显降低，镜下可见肾小管损伤减轻及肾内CaOx 晶体形成显着减少，这表明茶在此动物模型中具有很好的肾脏保护效果。此外，使用茶水干预后大鼠血清SOD 和CSH-Px活性明显提高，细胞凋亡程度明显减轻，这提示我们茶的肾脏保护效果很可能与其抗氧化作用有关。

综上所述,本研究结果显示，茶叶对大鼠泌尿系结石的形成有抑制作用，这很可能和它的抗氧化性有关。本研究结果对于从饮食方面预防泌尿系结石有很好的参考意义。