银杏外种皮乙醇提取物的抑菌活性

卜程洪，吴 进，朱洁林，董云富，张 博*

(1.兴义市农业农村局，贵州 兴义 562400； 2.兴义市南盘江镇农业服务中心，贵州 兴义 562400)

银杏(GinkgobilobaL.)又名白果，具备独特的形态特征、系统进化和分类地位。在银杏成熟之际，种植者通常将大量剥离的银杏外种皮弃于荒野或河流，让其在自然的条件下分化降解，如此不仅危害土壤有益微生物、河中鱼虾，还影响空气质量，造成严重的环境污染。刘进军等[1]采用新鲜银杏外种皮的滤液对樱花树的虫害有防治效果，而喷洒的滤液不影响樱花树的正常生长。魏艳等[2]利用银杏外种皮提取物中除去石油醚部分后，得到乙酸乙酯部分，对杂草枝苋幼根生长的抑制达74.4%，对芽生长抑制达46.4%，结果发现黄酮类化合物为主要除草活性成分。因此，笔者运用植物化学的方法提取制备了银杏外种皮的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的萃取物，以期检验银杏外种皮提取物对采绒革盖菌、腐皮镰孢、禾谷镰孢、尖孢镰孢和芸苔链格孢及大肠埃希氏菌、铜绿甲单孢菌、金黄色葡萄球菌和大肠沙门氏菌等病原菌的抑制作用，为银杏外皮的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试病原真菌采绒革盖菌、棉腐卧孔菌、腐皮镰孢菌、禾谷镰孢菌、灰葡萄孢菌、芸苔链格孢菌购自中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；病原细菌大肠埃希氏菌、大肠沙门氏菌亚种、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌亚种购自中国林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)。

1.2 银杏外种皮提取物不同极性部位的制备

用乙醇超声辅助提取银杏外种皮，通过旋转蒸发仪制备浸膏，用蒸馏水加热溶解，分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分别得到氯仿部分(CHCl3Fr.)、乙酸乙酯部分(EtOAc Fr.)、正丁醇部分(BuOH Fr.)，将水溶液部分置于大孔树脂AB-8柱中，分别用蒸馏水-40%甲醇、60%甲醇、100%甲醇进行洗脱，得到水溶液部分(H2O Fr.)、40%甲醇部分(40% MeOH Fr.)、60%甲醇部分(60% MeOH Fr.)、100%甲醇部分(100% MeOH Fr.)，将不同极性部分制备成浸膏待用。精确称取适量粗提物，用蒸馏水将粗提物溶解，通过0.22 mm微孔滤膜，配制成BuOH Fr.50 mg/mL、CHCl3Fr.50 mg/mL、EtOAc Fr.50 mg/mL、40% MeOH Fr.50 mg/mL、60% MeOH Fr.50 mg/mL、100% MeOH Fr.40 mg/mL、H2O Fr.100 mg/mL，置于4℃冰箱保存备用。

1.3 银杏外种皮提取物不同极性部位抑菌活性的测定

1.3.1 病原真菌生长 参考带毒平板法(生长速率法)测定[3]。每组重复3次，以无菌水作为空白对照，多菌灵作为阳性对照。于28℃的恒温培养箱中培养，隔天记录各菌落生长情况，以十字交叉法统计病原菌的生长直径，分别求出毒力回归方程、相关系数R和半抑制浓度(EC50值)。

1.3.2 病原细菌的生长 采用十倍稀释法制备菌悬液和牛津杯法[4]进行病原细菌的生长情况测定，每组试验重复3次。测量抑菌圈，计算平均值。抑菌直径≥20 mm为极敏感“+++”；15 mm≤抑菌直径<20 mm为高敏“++”；10 mm≤抑菌直径<15 mm为中敏“+”；抑菌直径<10 mm为低敏或无效“/”。

2 结果与分析

2.1 提取物不同极性部位的病原真菌抑制活性

由表1可见，银杏外种皮提取物对镰刀菌属有一定的抑制作用。

2.1.1 采绒革盖菌 银杏外种皮各部位粗提物对采绒革盖菌都具有较好的抑菌效果，CHCl3Fr.对彩绒革盖菌的抑菌活性最好，EC50为25.3 mg/mL，H2O Fr.的抑菌效果最差，EC50为54.3 mg/mL。

2.1.2 芸苔链格孢菌 BuOH Fr.和EtOAc Fr.对芸苔链格孢菌有较好的抑制效果，其EC50分别为8.1 mg/mL和8.9 mg/mL。而H2O Fr.对芸苔链格孢菌的抑制效果较差，EC50为100.3 mg/mL。

2.1.3 腐皮镰菌 BuOH Fr.和40% MeOH Fr.对腐皮镰菌的抑制效果较好，其EC50分别为19.6 mg/mL和23.3 mg/mL。

2.1.4 禾谷镰孢菌 BuOH Fr.和EtOAc Fr.对禾谷镰孢菌的抑制效果较好，其EC50分别为13.8 mg/mL和16.3 mg/mL。

2.1.5 尖孢镰孢菌 BuOH Fr.和H2O Fr.对尖孢镰孢菌的抑制效果较好，其EC50分别为8.4 mg/mL和10.6 mg/mL。

表1 银杏外皮不同极性部分的抑制毒力

2.2 提取物不同极性部位的病原细菌抑制活性

由表2可见，银杏外种皮粗提物的各部位对铜绿假单胞菌、大肠沙门氏菌亚种、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌亚种都具有一定的抑菌活性，其抑菌圈均>20 mm，相对敏感度均为+++；其中EtOAc Fr.对大肠埃希氏菌的抑菌圈最大，为(42.33±0.20)mm；其次是BuOH Fr.、EtOAc Fr.和CHCl3Fr.对金黄色葡萄球菌亚种，分别(36.00±2.83)mm、(36.00±0.47)mm、(36.00±2.25)mm。抑菌圈最小的是60% MeOH Fr.对大肠埃希氏菌，抑菌圈为(24.17±0.14)mm。H2O Fr.的样品浓度为100 mg/mL，其对铜绿假单胞菌、大肠沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种的抑菌效果与其他药液部分相比效果较差，而抑菌圈也较小，分别为(29.00±2.83)mm、(27.33±1.41)mm和(30.83±0.47)mm。银杏外种皮也可加工成饲料，抑制此类细菌在肠道的滋生。

表2 银杏外皮不同极性部位对4种病原细菌的体外抑菌活性

3 结论与讨论

试验通过银杏外种皮的粗提物对5株病原真菌和4株病原细菌进行抑菌活性测定表明，不同银杏外种皮粗提物各部分表现出不同的抑菌活性，随着药液浓度的增加抑制病原菌生长的效果也越明显，抑制率也越高。邓业成等[5]报道银杏外种皮的提取物酚酸类物质对柿子、水稻、梨、玉米、柑橘、甘蔗、西瓜和香蕉等植物致病的病原菌有抑制作用，半抑制浓度为0.665 7～19.558 0 mg/mL；对芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等多种病原细菌的抑制效果较好。这与本试验所得到的对病原菌没有广谱性效果的结果不同，可能是本试验未能针对性的提取银杏外种皮酚酸类物质有关，或本试验对不同的提取物进行溶解时，采用的无菌水溶解有关。本试验不采用有机溶剂溶解提取物，是去除有机溶剂毒害植物，测定真实水溶性成分的抑菌效果。

阳振等[6]报道银杏外种皮中银杏酚酸类是主要的抑菌成分，占外种皮提取物的65%，对于抑菌活性方面有很好的效果。通过抑菌活性试验发现，一方面可以为采绒革盖菌、腐皮镰菌、禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌和芸苔链格孢菌及大肠埃希氏菌、铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌和大肠沙门氏菌等病原菌的防治提供理论依据，开发植物源农药；另一方面为银杏外种皮的综合利用和开发提供新方向，并促进我国资源的利用、环境保护和生态和谐。