云南省勐腊县猪场PCV2和PCV3的感染状况

钟顺平，刘应华，杨贵伟，杨贵树，高利波*

(1.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201； 2.云南省勐腊县勐仑镇农业综合服务中心，云南 西双版纳 666303)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜的单股环状DNA病毒。2006年以前，全球范围内仅有猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)2个基因型[1]。PCV1感染后对猪无致病性[2]，而PCV2则可引起一系列猪圆环病毒相关病征，主要有断奶仔猪多系统衰竭综合征、繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征、先天性震颤、猪呼吸道疾病综合征、肠炎、增生性和坏死性肺炎等。自20世纪末爆发以来，PCV2已成为严重危害世界养猪业的病原体之一，造成巨大的经济损失[3]。2016年6月，美国首次报道新型猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)，猪感染后皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，厌食、妊娠母猪会出现繁殖障碍，生产性能下降，流产、产弱胎、死胎和木乃伊胎，产仔体弱，病情严重则造成急性死亡[4-5]。随着养猪业的不断发展，云南省猪病的发生越加复杂，为更好地了解和监控云南省勐腊县PCV2和PCV3的感染流行情况，采用PCR方法对2019年该地区送检的样品进行病原检测，以期为PCV2和PCV3的后续研究与防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测样品 检测样品86份，其中，血液样品59份，粪便样品27份，均采于云南省勐腊县规模化养殖猪场。

1.1.2 主要试剂与仪器 试剂：DNA提取试剂盒(百泰克生物技术有限公司)，2×Transhifi Super Mix II(含Tag TM DNA聚合酶，RNaase Inhibitor, dNTP,ddH2O，北京全式金公司)，DNA Marker DL1000、DL2000(大连宝生物公司)，琼脂糖(GENE公司)；其他试剂由云南农业大学动物传染病实验室提供，试剂均为分析纯。仪器：移液器(DRAGON公司，KA0052521)，超净工作台(苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1FD)，高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司，75005440)，凝胶成像系统(天能科技有限公司，Tanon-1600)，电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-7C)，普通PCR仪(BIO-RAD公司，580BR 12007)，恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司，HWS12)。

1.2 引物设计

根据NCBI GenBank中公布的PCV2(AF118095、AF118097、AF027217)和PCV3(KY075990、MF589106、KX966193)基因序列，分别设计针对PCV2和PCV3的特异性引物(表1)用于PCR检测。设计好的引物送至昆明硕擎生物公司合成。

表1 PCV2和PCV3基因扩增引物信息

Table 1 Primer information of PCV2 and PCV3 gene amplification

引物名称Primer name引物序列(5′-3′)Prime sequence目的片段/bp Target fragmentPCV2FATGACGTATCCAAGGAGGCGTT702PCV2RTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT702PCV3-FTTACTTAGAGAACGGACTTGTAACG651PCV3-RAAATGAGACACAGAGCTATATTCAG651

1.3 样品DNA提取

样品预处理、提取DNA均严格按照说明书进行，DNA于-20℃条件下冷冻备用。

1.4 PCR扩增

用提取的DNA作为模板进行PCR反应扩增，PCR反应体系：2×TransHiFiII 12.5 μL、ddH2O:10.5 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、DNA 1.0 μL，总的反应体系为25 μL。PCV2 PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35个循环；PCV3 PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35个循环；取10 μL PCR扩增产物配制成体系后加样到1.5%琼脂糖凝胶(含0.2%EB)孔中，并在120 V电压下进行30 min的电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并拍照。

1.5 PCR检测鉴定

利用特异性引物及对应的PCR检测方法检测采集的59份血液和27份粪便样品，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 PCV2感染情况

从图1看出，PCV2的电泳结果同预期目的片段大小(702 bp)相符，表明部分样品中PCV2检测呈阳性。在86份样品中，31份样品检测为PCV2阳性，阳性率为36.05%。59份血液样品中18份样品检测结果为阳性，阳性率为30.50%；27份粪便样品中13份样品检测结果为阳性，阳性率为48.15%。

注：1～10为PCV2抗原，11为阴性对照，M为Marker。

Note: 1-10,PCV2 antigen; 11, negative control; M, Marker.

图1 PCV2 PCR扩增电泳结果

Fig.1 PCR amplification electrophoresis results of PCV2

2.2 PCV3感染情况

从图2看出，PCV3的电泳结果同预期目的片段大小(651 bp)相符，表明部分样品中PCV3检测呈阳性。86份样品中，15份样品检测为PCV3阳性，阳性率为17.44%。59份血液样品中11份样品检测结果为阳性，阳性率为18.64%；27份粪便样品中4份样品检测结果为阳性，阳性率为14.81%。

注：1为PCV3抗原对照，2～9为PCV3抗原，M为Marker。

Note:1, PCV3 antigen control; 2-9, PCV3 antigen; M, Marker.

图2 PCV3 的PCR扩增电泳结果

Fig.2 PCR amplification electrophoresis results of PCV3

2.3 PCV2和PCV3混合感染情况

在送检的86份样品中，有13份样品同时检测到PCV2和PCV3阳性，混合感染率为15.12%。59份血液样品中有8份同时检测到PCV2和PCV3阳性，混合感染率为13.56%；27份粪便样品中有5份同时检测到PCV2和PCV3阳性，混合感染率为18.52%。

3 结论与讨论

对云南省勐腊县部分猪场采集的86份血液及粪便样品PCR检测结果表明，31份样品检测为PCV2阳性，阳性率为36.05%，比彭洁等[6]2013-2015年对云南省部分猪场猪组织样品检测的PCV2阳性率(17.65%～21.59%)高14.46～18.40百分点，比罗晓燕等[7]2015-2017年对云南玉溪部分猪场PCV2的病原阳性率(5.67%)高30.38百分点，原因可能是勐腊县气温高，更适宜病毒的传播，这和张治涛等[8]的报道相符。曾彩虹等[9]研究发现，2017-2018年云南省8个地(市)12个县(区)检测出PCV3阳性样品，阳性率为9.98%，表明PCV3已在云南省的多个地区普遍存在。研究检测发现，PCV3的阳性率为17.44%，较2017—2018年高，说明PCV3的感染愈加广泛。在送检的样品中，PCV2和PCV3混合感染的有13份，混合感染率达15.12%，感染率较高。表明，PCV2和PCV3在勐腊县呈一定的流行趋势，应加强对该病的防控工作。

PCV严重侵害猪的免疫系统，导致患病猪只体况下降，很容易导致猪群中同时有多种疾病综合征发生。自我国2000年首次报道PCV2后，该病已经在我国猪场中广泛存在，阳性感染率都比较高，给养猪业的发展形成了巨大的威胁[5，10-11]。KU等[12]首先报道在中国猪群中存在PCV3感染，在所检测的辽宁省、江西省等10个省市样品中均可检测到PCV3。截至目前我国已有20余个省份陆续报道猪场存在PCV3感染与流行，且疾病的发生呈现上升趋势，感染的范围越来越广泛[13-15]。勐腊县生猪规模化养殖水平较低，主要以家庭式养殖为主，且饲养环境较差，容易使猪只免疫力降低，给病原的入侵提供了条件，各种传染病很容易流行。动物防疫部门和养殖户需采取相应的防控措施，加强对猪群的饲养管理。