甲醇致SK-N-SH 细胞氧化应激及DNA 损伤的研究

严 姣， 李亚妮， 郝乐乐， 宋 辉， 刘贺荣， 陈 楠

（宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004）

甲醇是一种有毒的酒精气味液体。目前已经被大规模生产并使用，且甲醇职业人群也相应增加，这就为我国的职业卫生工作提出了新的挑战。甲醇主要经消化道、呼吸道、皮肤进入机体后可致眼毒性、代谢性酸中毒、神经毒性[1]。目前，国内外对于甲醇的毒性多集中于眼部损害及代谢性酸中毒，对中枢神经系统作用主要集中在影像学方面[2]，而甲醇中枢神经毒性研究较少。本课题组前期发现[3]甲醇对大鼠染毒后对大鼠大脑产生氧化应激作用并可激活线粒体细胞凋亡途径引起神经细胞凋亡。甲醇可以致机体产生氧化应激[4]，另有研究报道[5]甲醇可以诱导线粒体DNA 损伤。因此本课题研究以甲醇为受试物，对人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）进行染毒后，用流式细胞仪、单细胞琼脂糖凝胶电泳检测细胞氧化应激水平、DNA 损伤情况，探讨SK-N-SH 细胞氧化应激与DNA 损伤情况及二者的关系，为甲醇的神经毒性研究提供进一步的科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

甲醇（天津瑞金特化学品有限公司，中国），胎牛血清（Biological Industries，以色列），MEM 培养基（上海中桥新舟，中国），活性氧（ROS）检测试剂盒（碧云天，中国），荧光显微镜（Olympus，日本），流式细胞仪（Sysmex，日本），电泳仪（Tanon，中国）。

1.2 细胞培养与染毒

本课题组前期通过CCK-8 法检测SK-NSH 细胞增殖活力[6]，分别用0、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000 mmol·L-1浓度的甲醇染毒24、48 h，染毒48 h 后拟合的线性回归方程为Y=1.10767-0.00047X，R2=0.98，可以看出随着染毒剂量的增加，细胞毒性也逐渐增强。通过拟合的回归方程可计算出IC50=1292.96 mmol·L-1，由此选择0、250、750、1250 mmol·L-1为染毒剂量组。

SK-N-SH 细胞（购买于上海科学院细胞库）用完全培养液（10%FBS+89%MEM+1%抗生素）重悬，加入3 mL 细胞悬液于培养瓶中，37 ℃，5%CO2培养箱培养。每2 d 换液1 次，3～4 d 传代1次。取同批次对数期生长良好的细胞将其制成2.5×105/mL 细胞悬液，分别接种于对照、低、中、高甲醇浓度组，每组3 孔，每孔2 mL 的6 孔板中，24 h 后弃旧培养液，加入含不同浓度甲醇（0、250、750、1250 mmol·L-1）的新培养液1.5 mL，染毒24 h。

1.3 流式细胞仪检测ROS 水平

染毒24 h 后，用胰酶（不含EDTA 和酚红）消化细胞，收集细胞于离心管中，1000 r·min-1，离心5 min，弃上清。PBS 洗涤细胞2 次，800 r·min-1离心3 min，加入1 mL DCFH-DA（按照1∶4000 用无血清培养液稀释），37 ℃孵育30 min。洗涤3 次，每次5 min，800 r·min-1离心3 min 后，加入300 μL 无血清培养液重悬细胞。用流式细胞仪进行检测，其结果采用Flowjo 软件分析。实验重复3 次。同样方法处理细胞后荧光显微镜下直接观察细胞内ROS 荧光强度。

1.4 单细胞琼脂糖凝胶电泳检测DNA 损伤

染毒24 h 后，消化收集细胞，制成单细胞悬液。取10 μL 细胞（大约5000 个）加120 μL 0.5%LMP 混匀，滴加到制备含1.5% NMP 的载玻片上，放置。10 min 后，将其置于细胞裂解液中，4 ℃避光裂解至少1 h。取出玻片，无菌水清洗3 次，将其置于电泳槽，加入碱性的电泳缓冲液，4 ℃避光解旋30 min。25 V、300 mA 电泳30 min。缓冲液中和2 次，每次10 min，吸去残留液体，无菌水清洗载玻片，室温晾干，滴加30 μL EB 染色。荧光显微镜观察每一浓度随机选择100 个细胞，记录拖尾细胞数，计算拖尾率。采用CometIMI 软件记录拖尾细胞数及测量拖尾长度。拖尾率（%）=拖尾细胞数/总观察细胞数。平均拖尾长度（μm）=拖尾长度之和/拖尾细胞数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素的方差分析，两两比较采用LSD-t法。关联性分析采用Pearson 相关分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ROS 水平变化

对照组、低、中、高浓度甲醇组细胞内ROS水平分别为（7.72±2.10）%、（10.88±2.60）%、（12.87±1.17）%、（15.83±1.60）%，组间比较差异有统计学意义（F=9.23，P<0.05）。与对照组相比，中、高浓度组细胞内ROS 水平上升（P均<0.05）；与低浓度甲醇组相比，高浓度甲醇组细胞内ROS 水平上升（P<0.05）。见图1、表1。

表1 甲醇染毒SK-N-SH 细胞24 h 后细胞内ROS 水平（±s）

表1 甲醇染毒SK-N-SH 细胞24 h 后细胞内ROS 水平（±s）

与对照组相比*P<0.05，**P<0.01；与低浓度甲醇组相比#P<0.05

组别 n ROS 水平/%对照组 3 7.72±2.10低浓度甲醇images/BZ_41_1533_1468_1540_1470.png组 3 10.88±2.60中浓度甲醇组 3 12.87±1.17*高浓度甲醇组 3 15.83±1.60**#

2.2 DNA 损伤程度

如图2、表2 所示，对照组、低、中、高浓度组细胞发生拖尾的平均拖尾长度分别为（19.03±4.58）μm、（52.85±21.60）μm、（72.95±15.29）μm、（73.62±16.80）μm，组间比较差异具有统计学意义（F=26.09，P<0.01）。对照组、低、中、高浓度甲醇组细胞发生拖尾的拖尾率分别为（3.15±0.97）%、（23.92±5.02）%、（58.74±18.27）%、（61.78±11.10）%，组间比较差异具有统计学意义（F=66.32，P<0.01）。与对照组相比，低、中、高浓度甲醇组平均拖尾长度及拖尾率升高（P均<0.01）；与低浓度甲醇组相比，中、高浓度甲醇组平均拖尾长度及拖尾率升高（P均<0.01）。

表2 甲醇染毒SK-N-SH 细胞24 h 后细胞内DNA 损伤水平变化（±s）

表2 甲醇染毒SK-N-SH 细胞24 h 后细胞内DNA 损伤水平变化（±s）

与对照组相比**P<0.01；与低浓度甲醇组相比##P<0.01

组别 n 平均拖尾长度/μm 拖尾率/%对照组 3 19.03±4.58 3.15±0.97低浓度甲醇组 3 52.85±21.60** 23.92±5.02**中浓度甲醇组 3 72.95±15.29**## 58.74±18.27**##高浓度甲醇组 3 73.62±16.80**## 61.78±11.10**##

2.3 ROS 与DNA 损伤相关性分析

ROS 水平与DNA 拖尾长度呈正相关关系（r=0.818，P<0.01），表明随着氧化应激水平增加神经细胞DNA 损伤水平也增加。

3 讨论

甲醇广泛生产使用给人们带来效益与便利，但是对职业人群也造成不可忽视的损伤。甲醇中毒是全球性问题，在幸存者中死亡率高，长期存在视觉后遗症和严重的脑损伤[7]。有研究表明[8]，甲醇可引起大鼠神经胶质纤维酸性蛋白星形胶质细胞数量明显减少及海马区严重的记忆障碍。Bezdicek 等[9]进行横断面研究发现甲醇中毒会导致执行功能障碍和记忆力减退。Kang 等[10]通过职业中毒事件发现不良环境控制下的甲醇暴露不仅会产生眼部损伤和中枢神经系统症状，还影响其神经行为和视神经功能。课题组前期研究表明，甲醇可导致大鼠神经细胞凋亡，出现神经行为异常改变[11]，而氧化应激是许多神经系统性疾病的关键起始因子[12]，其主要被认为参与阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等神经退行性疾病[13]。由于大脑的抗氧化防御机制相对较差，可刺激神经细胞发生氧化应激产生ROS。ROS 的过量产生会损害细胞生物分子，如蛋白质、脂质和核酸，并诱导多种类型细胞中的DNA损伤。有研究报道[14]，当中枢神经系统损伤时，ROS 主要攻击对自由基特别敏感的有丝分裂后的细胞，如神经胶质细胞和神经元。本实验中对照、低、中、高浓度甲醇分别作用于SK-N-SH 细胞24 h 后，不同浓度甲醇染毒SK-N-SH 细胞内ROS 水平升高，随着染毒浓度增加，甲醇各浓度组细胞内ROS 相对水平增高，这表明甲醇对SK-N-SH 细胞产生的损伤可能与其细胞内ROS水平有关。

ROS 的水平增加也是DNA 损伤的一种机制，ROS 引起的氧化应激和各种原因诱导的DNA 损伤超过了机体自我修复的能力将会对机体造成各种损伤[15]。DNA 损伤在神经元中的积累与神经退行性疾病的发生也有关，已知的很多神经退行性疾病都是由于DNA 损伤缺陷引起的[16]。本实验中对照、低、中、高浓度甲醇分别作用于SK-N-SH 细胞24 h 后，采用彗星实验技术检测SK-N-SH 细胞DNA 损伤情况，显微镜下拍照发现随着甲醇浓度增高，细胞发生拖尾的数量逐渐增多，拖尾长度也逐渐增长。随着甲醇染毒浓度增加，平均拖尾长度及细胞拖尾率也增加，提示甲醇可能会诱导神经细胞发生DNA 损伤，且浓度越大，损伤程度可能越严重。

诸多研究发现氧化应激与DNA 损伤之间关系密切。DNA 损伤可能是由直接与DNA 相互作用或通过氧化应激诱导的ROS 产生引起的[17]。Jiao 等[18]研究表明甲基丙烯酰基乙基十六烷基氯化铵通过产生氧化应激，从而通过修饰信号转导途径触发诱导人牙髓细胞DNA 损伤。Pignataro等[19]利用细胞质杂交细胞发现当神经母细胞瘤细胞分化为多巴胺能神经元样细胞时，PD 63 细胞内ROS 水平和慢性DNA 损伤应答激活之间呈正相关，这表明ROS 的产生确实是导致细胞核DNA 损伤的原因。Chang 等[20]研究发现抑郁症可能是通过增加ROS 的产生而导致线粒体DNA氧化性损伤。Rawat 等[21]研究表明高胆红素诱导的氧化应激似乎是导致体外DNA 损伤的主要机制。这些研究都表明氧化应激可直接参与引起DNA 损伤的反应。本次实验中DNA 损伤的结果与甲醇造成的细胞ROS 含量变化的结果相一致，且通过ROS 水平与DNA 损伤相关性分析得出二者之间有相关关系且呈高度相关，这也说明甲醇的暴露导致细胞内ROS 含量的升高，从而引起了细胞的脂质过氧化反应，对细胞的DNA造成了氧化损伤。

综上所述，甲醇能诱导SK-N-SH 神经细胞能产生氧化应激与DNA 损伤，其可能的机制是通过诱导SK-N-SH 细胞发生氧化应激从而产生DNA 损伤反应，但是此结论还需要通过后续实验进一步的研究来证实这一可能机制。