柠檬苦素抑制胃癌细胞转移的作用及机制研究

刘伯霞， 申 琴， 焦海燕， 李 涛， 陈 静

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004； 2.宁夏回族自治区生育力保持教育部重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院肿瘤外科，银川 750004）

胃癌是一种严重威胁人类生命的致死性疾病，全球每年约723000 人死于胃癌[1]。由于胃癌早期一般没有明显症状，胃癌被确诊时通常已是晚期，并伴有肝、肺、腹膜和淋巴结的转移。一旦形成远处转移灶，患者5 年生存率下降到10%以下，中位生存期为9～10 个月[2]。目前，手术、放疗以及化疗是治疗胃癌的主要手段，但由于晚期胃癌患者术后会出现肿瘤转移和复发，提高患者总体生存率仍然是一个巨大的挑战[1]。因此，开发有效抗肿瘤转移的药物显得尤为迫切。有研究证实[3]，源于中草药的单体和提取物不仅毒性小，且具有显著的抗肿瘤效果，已成为目前抗癌药物研究的热点。2017 年欧洲科学家调查发现，柑橘属水果，对消化系统和上呼吸道癌症有很好的预防作用[4]。随着柑橘综合利用的深入，各种有效成分逐步被提取和分离出来，尤其以存在于桔皮及柚皮中柠檬苦素（limonin）在预防和控制肿瘤方面显示良好的效果[5]。因其药理作用强，毒性低，不良反应轻而受到越来越多学者的重视与青睐，但其对于胃癌细胞转移的抑制作用及相关信号通路和靶点的研究，国内外鲜见报道。信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）作为一种已知与癌细胞增殖和转移相关的致癌转录因子，磷酸化后与STAT 家族的其他成员形成同源二聚体或异二聚体。随后，活化的STAT3 复合物易位到细胞核中，启动STAT3 靶基因的转录，其中就包括基质金属蛋白酶9（MMP-9）[6]，而MMP-9 的表达与胃癌的恶性程度呈正相关[7]，提示MMP-9 是胃癌转移过程中的一个重要因素。因此，本研究旨在初步探讨柠檬苦素抑制胃癌细胞体内外转移的作用以及与STAT3/MMP-9 信号通路的相关性，以便为阐明柠檬苦素的抗癌新功能和抗肿瘤新机制以及研发具有我国自主知识产权的肿瘤生物治疗药物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 二氧化碳培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司），倒置荧光显微镜（OLYMPUS 公司），PCR 仪（Bio-Rad 公司），SDSPAGE 电泳设备（Bio-Rad 公司），低温离心机（4 ℃）（Eppendorf 公司），全波长酶标仪（Thermo Fisher

公司）。

1.1.2 细胞 人源的胃癌细胞（BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS）均受赠于上海华东师范大学生科实验室。

1.1.3 试剂及抗体 RPMI 1640 培养基（Multi－Cell Technologies 公司），DMEM 培养基（MULTICELL 公司），胎牛血清（MultiCell Technologies 公司），0.25%Trypsin-EDTA（1X）（Gibco 公司），icro BCATMProtein Assay Kit（Thermo Fisher 公司），TRIzol（Life Technologies 公司），RecertAid First Strand cDNA Synthesis Ki（tThermo Fisher 公司），CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega 公司），Rabbit mAb（Cell Signaling Technology 公司），Mouse mAb pTyr705-STAT3（D3A7）XP（Cell Signaling Technology 公司），GAPDH（北京中杉金桥公司），anti-CD31 antibody（Arigobio 公司），MMP-9（D603H）XPRabbit mAb（Cell Signaling Technology 公司）。

1.1.4 实验动物 SPF 级6 周龄雌/雄性BALB/CA（nu/nu）裸鼠，购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 MTS 增殖实验检测胃癌细胞存活率 取生长状态良好的胃癌细胞株（BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803）用0.25%含EDTA 的胰酶消化处理后，以每孔4.5×104～5.0×104个细胞接入96 孔板。贴壁后进行不同浓度柠檬苦素（0、180、260、340、420、500 μmol·L-1）处理。干预72 h 后加入20 μL CellTiter 96AQueous One Solution 继续培养1～2 h，使用酶标仪测该样品在490 nm 处的光密度（OD）值，独立重复实验3 次。将未加药孔作为空白对照组，加药孔为实验组，存活率（%）=（实验组OD 值/对照组OD 值）×100%，作图，通过GraphPad Prism 进行IC50的计算。

1.2.2 划痕愈合实验方法检测胃癌细胞迁移率 取对数生长期的胃癌细胞（BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803），用胰酶消化后分别接种在6 孔板中，当细胞密度达到95%时，用黄枪头沿培养皿底部呈“一”字形划痕，PBS 冲洗细胞3 次后，柠檬苦素（0、20、40、60 μmol·L-1）处理12～24 h，待对照组（0 μmol·L-1）划线部分愈合后，4%多聚甲醛固定20 min 后拍照，观察柠檬苦素对细胞迁移能力的影响。迁移率（%）=（实验组迁移细胞数目/对照组迁移细胞数目）×100%，然后作图。

1.2.3 裸鼠胃癌腹腔种植转移模型 将生长状态相似的健康BALB/CA（nu/nu）裸鼠［雌雄数量各半，体质量（20±2）g］随机分为空白对照组（无菌1×PBS）、柠檬苦素低剂量组（12.5 mg·kg-1）和柠檬苦素高剂量组（25 mg·kg-1），每组12 只。每只裸鼠腹腔注射给药50 μL/次。提前连续给药7 d后，将胃癌细胞BGC-823 株以每只裸鼠腹腔注射0.2 mL 细胞悬液（1×107个细胞）接种后，连续给药至28 d。造模成功后，每7 d 每组随机处死2 只裸鼠，取出肺、肠拍照观察肿瘤转移灶数量和体积变化，然后用4%多聚甲醛固定进行组织石蜡包埋和常规免疫组织化学染色。

1.2.4 蛋白免疫印迹（Western blot）检测胃癌细胞中STAT3 磷酸化水平 胰酶处理收集经柠檬苦素（0、20、40、60 μmol·L-1）处理后的胃癌细胞株BGC-823，用预冷PBS 清洗细胞3 遍，加入预冷RIPA 裂解细胞30 min 后，离心15 min 收集上清液，进行BCA 蛋白定量。使用5×还原型上样缓冲液稀释混匀，沸水煮10 min 后，SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白，之后将蛋白转运到PVDF 膜上，用5% BSA 封闭1 h 后，加入相应的一抗稀释液4 ℃慢孵过夜后，二抗室温孵育1～2 h，使用ECL 化学发光液曝光检测pTyr705-STAT3、STAT3 和内参的表达情况，利用Image J 软件分析各条带灰度值，相对表达强度=pTyr705-STAT3灰度值/ STAT3 条带灰度值。

1.2.5 免疫组织化学方法检测胃癌组织中pTyr705-STAT3 和MMP-9 表达水平 对石蜡包埋标本的5 μm 切片进行免疫组织化学染色，并用Ki-67，p-STAT3 和MMP-9 抗体进行染色。使用Leica 显微镜（Leica，DM4000b）拍照。200 倍显微镜下观察到胞核内有棕色颗粒者即为阳性细胞，每个样本随机选取10 个视野，通过Image J 软件进行细胞计数，阳性表达率（%）=（阳性细胞数／全部细胞数）×100%。

1.3 统计学方法

所有数据均采用GraphPad Prism 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用Dunnet-t检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柠檬苦素对胃癌细胞增殖的影响

MTS 细胞增殖实验结果发现，柠檬苦素在500 μmol·L-1浓度下对多种胃癌细胞增殖的半数抑制率不足50%（IC50），尤其对BGC-823 增殖的抑制率仅为7.47%。提示柠檬苦素对肿瘤细胞的增殖无抑制作用（图1）。

2.2 柠檬苦素对胃癌细胞迁移的影响

划痕愈合实验结果显示，在较低浓度下（40、60 μmol·L-1），柠檬苦素能抑制具有高迁移能力的多种胃癌细胞（BGC-823、SGC-7901、AGS 和MGC-803）向空白区域迁移，且在40 μmol·L-1浓度下抑制率高于50%（P<0.05），在60 μmol·L-1浓度下抑制率进一步增强，实验组与对照组抑制率差异均有统计学意义（P均<0.05）（图2）。

2.3 柠檬苦素对体内肿瘤转移的影响

为了验证柠檬苦素在体内预防肿瘤和抗肿瘤转移的作用，在建立裸鼠胃癌腹腔种植转移模型之前，首先给予7 d 的柠檬苦素预处理。如图3A 结果显示，对照组中，裸鼠给药处理后7 d 组与0 d 组比较，裸鼠各器官的颜色均无明显差异；裸鼠给药后14 d 组和21 d 组与7 d 组对比，肿瘤的数量和体积均明显增加。加药组中，柠檬苦素实验组较对照组可显著减少肿瘤转移灶的数量以及肿瘤的体积，随着柠檬苦素剂量的增加，肿瘤转移灶的数量和体积越来越少，肉眼下肠系膜上转移灶的数量和体积变化显著。从壁腹膜的局部图能够看出，21 d 时25 mg·kg-1柠檬苦素的剂量下，壁腹膜中的肿瘤数量和体积较对照组明显减少（图3B），且小鼠体质量改变不明显（图3C），提示柠檬苦素在该剂量下对小鼠的毒性较小且能显著抑制肿瘤的转移。

2.4 柠檬苦素对胃癌组织中p-STAT3、MMP-9、Ki-67 表达的影响

免疫组化结果显示，0、12.5、25 mg·kg-1柠檬苦素实验组中经p-STAT3 染色后的阳性细胞数逐渐降低［（32.13±0.4787）%、（23.48±0.6455）%、（8.973±0.7071）%］，柠檬苦素实验组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P均<0.01），其下游MMP-9 的阳性率也明显下降［（40.59±0.9129）%、（11.27±1.472）%、（7.353±1.780）%］，柠檬苦素实验组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P均<0.01），对细胞增殖相关因子Ki-67 无明显影响（图4），提示柠檬苦素抑制胃癌转移可能是通过STAT3 介导的MMP-9 信号通路发挥生物学功能。

2.5 柠檬苦素对胃癌细胞中STAT3 磷酸化的影响

Western blot 实验结果表明，与对照组相比，在20、40、60 μmol·L-1的柠檬苦素作用下，均阻断胃癌BGC-823 细胞磷酸化STAT3（Tyr705）的激活（P均<0.01），STAT3 总蛋白和内参蛋白β-actin的表达量不变（图5）。

3 讨论

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。中国是全球胃癌发病率最高的国家之一。而肿瘤转移和复发是有效和成功治愈癌症的主要障碍，并且与多种癌症的发病率和死亡率密切相关[8]。STAT3 是一种潜在的细胞质转录因子，其在多种癌症中被结构性激活，并且在肿瘤的生长和转移中发挥关键作用。靶向STAT3 激活可以在不影响正常细胞的情况下，在体内外抑制肿瘤的生长和转移，表明STAT3 可能是肿瘤治疗的有效分子靶点[9]。因此，寻找合适的STAT3 抑制剂成为抗肿瘤转移的重要策略。

从柑橘柚子类果核中提取的柠檬苦素，作为一类中草药单体化合物，研究证实其具有显著的抗肿瘤作用，能够抑制肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤的生长。Langeswaran 等[10]发现柠檬苦素主要通过稳定Wnt 信号通路诱导HepG2 细胞凋亡，是一种对人类肝癌HepG2 细胞有效的抗增殖剂。Kim 等[11]发现柑橘类柠檬苦素类似物可能通过caspase-7 相关的通路预防ER-乳腺癌（MCF-7）。Somasundaram 等[12]研究发现，柠檬苦素可能有益于乳腺癌患者的化疗疗效。总之，现有关于柠檬苦素抗癌活性已被逐渐证实，但是对于抗胃癌转移的研究尚未报道[13]。本研究首次探讨柠檬苦素与STAT3 信号通路之间的关系，并研究其抗肿瘤转移的效果及作用机制，从体内和体外水平证实柠檬苦素作为STAT3 信号通路潜在的抑制剂，通过抑制STAT3 的活化从而达到抗胃癌转移的作用。在体外的功能研究发现胃癌细胞（BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803）经柠檬苦素处理后，显著抑制细胞迁移能力，在40 μmol·L-1的低浓度下，对其增殖的影响微小，这也说明低浓度的柠檬苦素对细胞无毒性，提示柠檬苦素可能成为一种安全、经济的抗肿瘤转移治疗药物。鉴于柠檬苦素在许多类型的癌症中具有降低风险的潜力，本研究提前7 d 腹腔注射柠檬苦素，结果表明柠檬苦素可以预防和治疗胃癌的腹腔转移。具体表现为转移灶数量的减少和体积的减小。且7 d 组解剖后与0 d 组解剖的结果对比，肉眼观察小鼠各器官的色泽、大小、黏度均无明显变化，提示该剂量下柠檬苦素对小鼠无明显毒性。

MMP-9 与多种类型的实体瘤的侵袭和转移潜能密切相关[14]，在柠檬苦素诱导的抑制胃癌细胞转移的过程中起关键作用。本研究通过免疫组织化学染色证明，柠檬苦素处理显著抑制了裸鼠胃癌腹膜转移灶中MMP-9 的表达。MMP 能够降解ECM 和基底膜的各种成分。一旦MMP-9 被激活，它能够降解ECM 中的胶原蛋白，从而增加癌细胞的转移[15]。因此，柠檬苦素对MMP-9 蛋白表达的抑制可能是柠檬苦素抑制胃癌转移的重要机制之一。此外，柠檬苦素处理可抑制STAT3 的激活。STAT3 的异常激活与恶性肿瘤的进展密切相关[16]。因此，柠檬苦素抑制STAT3 激活可能会阻碍肿瘤的进展。此外，STAT3/MMP-9 途径已被证明参与结肠癌细胞的侵袭[17]。本研究在胃癌细胞中获得了类似的结果，提示STAT3/MMP-9 途径可能介导柠檬苦素对胃癌细胞转移的抑制作用。这表明柠檬苦素可以作为一种广谱的STAT3抑制剂，本研究只对柠檬苦素与STAT3/MMP-9信号通路之间的联系进行了研究，而关于柠檬苦素抗肿瘤转移方面可能还存在一些未知的机制，有待进一步的深入探究。

综上，柠檬苦素能够抑制多种胃癌细胞的转移能力，其机制可能是通过调控STAT3 介导的MMP-9 信号通路而发挥作用。本项目的理论成果进一步延伸性提示，柠檬苦素及其结构衍生物可能是一类具有潜在低毒性的预防及抗癌药物，因此，对柠檬苦素类似化合物进一步的开发具有重要的社会意义和潜在的经济价值。