枸杞多糖通过NF-kB 信号通路干预雷公藤多苷生殖损伤作用的实验研究

李一田， 王 璐， 崔瑞琴，2

（1.宁夏医科大学中医学院，银川 750004； 2.生育力保持教育部重点实验室，银川 750004）

雷公藤多苷（tripterygium wilfordii glycosides，GTW）是从雷公藤根芯部提取的一种脂溶性混合物，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等功效。自1987年首次报道[1]GTW 可用于治疗儿童过敏性紫癜性肾炎（henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN），经过30 多年的临床实践证实，GTW 具有确切的降低蛋白尿和血尿、消除水肿的作用[2-5]。但是，GTW 也引起一些严重不良反应的临床个案，其中生殖系统的不良反应更是引起广泛关注。因此，研究GTW 的损伤机制对临床安全用药具有重要意义。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是中药枸杞的重要有效成分之一。LBP 具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、调节血糖、降血脂、抗辐射、神经保护、生殖系统保护等多种生物功效[6]。本课题组前期的实验结果已经证明，LBP 可通过上调大鼠睾丸组织中Bcl-2的表达来发挥促进GTW 所致生殖损伤的修复作用[7]，而Bcl-2 是核因子-kB（nuclear factor-kappab，NF-kB）信号通路下游的重要靶点之一，具有抑制细胞凋亡的作用。因此，本实验是在前期研究基础上，基于NF-kB 信号通路进一步探索LBP 拮抗GTW 生殖损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠30 只，3 周龄，体质量（60±10）g，SPF 级，购买自宁夏医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK（宁）2015-0001）。SPF 级动物房饲养，温度（25±1）℃，湿度（50±10）%，自由进食、饮水。常规环境适应性饲养7 d 后开始实验。

1.2 主要实验试剂和药品

雷公藤多苷片（GTW，规格10 mg/粒，100 粒/瓶，江苏美通制药有限公司，批号：Z32021007）；LBP（95%浓度，宁夏宏德生物技术有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，天津市凯通化学试剂有限公司）；兔抗鼠p-p65、p65、Bcl-2、IKBα、βactin 及辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（北京博奥森公司）；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。

1.3 动物分组及给药方法

将3 周龄雄性SD 大鼠随机分为空白对照组（C 组，10 只），雷公藤多苷组（GTW 组，10 只）和枸杞多糖+雷公藤多苷组（LBP+GTW 组，10 只）。给药剂量依据临床实际用药量经计算后折算为等效剂量：大鼠剂量（mg）=6.3×成人剂量（mg）。C组给予0.5%浓度CMC-Na 液，灌胃给药，1 次/d，连续8 周；GTW 组灌服12.6 mg·kg-1的GTW 混悬液，灌胃给药，1 次/d，连续8 周；LBP+GTW 组灌服12.6 mg·kg-1GTW+160 mg·kg-1LBP，两种药液间隔2 h 灌胃给药，1 次/d，连续8 周。GTW 和LBP两种药液均用0.5%CMC-Na 溶液混悬。给药容积均为1 mL/100 g。末次给药2 h 后先称重，后用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射，麻醉后取睾丸，称湿重；一侧睾丸在两端扎眼，置于4%多聚甲醛液中固定，另一测睾丸置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 指标测定

1.4.1 脏器指数 脏器指数=单侧睾丸湿重/体质量。

1.4.2 组织病理 多聚甲醛中睾丸组织经固定48 h 后取出并流水冲洗2 h，按垂直睾丸长轴方向，切为2 个2～3 mm 厚的组织片，乙醇梯度脱水后二甲苯透明，石蜡包埋后于阴凉处过夜，次日将蜡块以8 μm 厚度切片置于47 ℃水展开，用载玻片捞片后以58 ℃烤片2 h。将切片进行常规HE 染色后，放于阴凉干燥处晾干，光学显微镜下观察并拍照。1.4.3 IKBα、p65、p-p65、Bcl-2 蛋白表达 从-80 ℃冰箱中取出睾丸，4 ℃匀浆并提取全蛋白，最后用BCA 方法进行蛋白定量。按照试剂盒说明严格操作：使用10% SDS-PAGE 分离胶电泳，4 ℃层析柜转膜；p-p65 使用2%浓度牛血清白蛋白（BSA）封闭，其他待测蛋白及内参选用5%脱脂奶粉封闭，时间均为2 h；稀释一抗及内参（稀释比例1∶400）后室温摇床孵育1 h，4 ℃摇床过夜；次日室温下复温1 h，TBST 洗膜5 min×4 次，再用HRP标记的二抗（稀释比例1∶4000）室温孵育1 h，TBST 洗膜5 min×4 次；之后ECL 曝光显色。用Image J 软件计算各组灰度值后与内参灰度值的比值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法检验，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量、睾丸质量以及脏器指数

给药8 周后，GTW 组大鼠体质量、睾丸质量、脏器指数较C 组及LBP+GTW 组均降低（P＜均0.05）；而LBP+GTW 组体质量、睾丸质量以及脏器指数与C 组相比差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

2.2 睾丸组织病理

与C 组比较，GTW 组睾丸组织曲细精管水肿，曲细精管间距增宽，曲细精管腔生殖上皮变薄，甚至可见上皮细胞松散，间质细胞排列杂乱，精原细胞、精母细胞显著减少；LBP+GTW 组曲细精管间距增宽，但幅度低于GTW 组，精原细胞、精母细胞数量稍有减少，间质细胞排列尚可，曲细精管形态无明显差异。见图1～2。

表1 各组大鼠体质量、睾丸质量、脏器指数的比较（±s）

表1 各组大鼠体质量、睾丸质量、脏器指数的比较（±s）

与GTW 组比较*P＜0.01，**P＜0.05

组别 体质量/g 睾丸质量/g 脏器指数/%C 组 450.00±33.47* 1.82±0.06* 0.44±0.03*GTW 组 370.63±18.02 1.60±0.05 0.39±0.03 LBP+GTW 组 438.75±38.43* 1.78±0.04* 0.43±0.03**F 值 14.359 48.368 7.134 P 值 ＜0.001 ＜0.001 0.004

2.3 睾丸组织中IKBα、p65、p-p65、Bcl-2 蛋白表达

与C 组比较，GTW 组p65、p-p65 蛋白表达水平均升高（P均＜0.01），IKBα、Bcl-2 蛋白表达水平均降低（P均＜0.01）；LBP+GTW 组p65、p-p65、Bcl-2 蛋白表达水平均升高（P均＜0.01），IKBα蛋白表达水平降低（P＜0.01）。LBP+GTW 组IKBα、p65、p-p65 及Bcl-2 蛋白表达水平均高于GTW 组（P均＜0.01）。见图3、表2。

表2 各组IKBα、p65、p-p65、Bcl-2 与β-actin 灰度值比值的比较（±s）

表2 各组IKBα、p65、p-p65、Bcl-2 与β-actin 灰度值比值的比较（±s）

与C 组比较*P＜0.01；与LBP+GTW 组比较#P＜0.01

组别 IKBα p65 p-p65 Bcl-2 GTW 组 0.5022±0.0330*# 2.0649±0.0819*# 1.2155±0.0744*# 0.9567±0.0325*#LBP+GTW 组 0.6215±0.0152* 3.0524±0.1268* 1.3788±0.0453* 2.3295±0.0503*C 组 0.7360±0.0458 1.1494±0.0806 0.9456±0.0607 1.8060±0.0081 F 值 47.971 278.329 50.952 1577.237 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

雷公藤及其制剂的生殖损伤作用，在男性表现为精子细胞中酶的活性受到抑制，精子产生和成熟过程障碍，数量显著减少，活力降低，畸形率增加；在女性主要表现为月经紊乱，经量减少或闭经；雌二醇、孕酮水平降低，卵泡刺激素、促黄体生成素增高，甚至卵巢早衰、子宫萎缩[8]。本实验结果同样说明，GTW 可使大鼠睾丸质量和脏器指数降低，曲细精管水肿，管腔上皮变薄松散，精原细胞和精母细胞数量减少。《素问·上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛……八八，则齿发去。”人体生殖器官的生长发育，性机能的成熟与维持，都与肾紧密相关，肾精充，肾气沛，则精气溢泻，男女阴阳和合而有子，肾精、肾气不足，可导致男女生殖器发育不良和生殖能力衰弱，因此中医在治疗生殖系统疾病时尤为注重补肾填精。故本实验通过中药补肾的方法进一步研究GTW 减毒增效机制。

枸杞，又名枸杞子，药用部分是果实。性甘、平，归肝、肾经，可滋补肝肾，益精明目。《本草纲目》载：“枸杞，补肾生精，养肝明目，坚精骨，去疲劳，易颜色，变白，明目安神，令人长寿。”明代《摄生众秒方》所载五子衍宗丸是枸杞治疗肾虚精少的代表方剂，方中枸杞为君，发挥平补肝肾、填精补血功效。宁夏枸杞是道地药材，功效更佳，枸杞研发对道地药材的保护开发和宁夏的经济、民生都具有重要意义。作为枸杞重要有效成分之一的LBP 的组成包括中性糖（81.37%）、蛋白质（9.42%）和半乳糖醛酸（3.69%）。大量研究显示[9-11]，LBP对雄性大鼠睾丸组织损伤及生殖细胞损伤具有明显的保护修复作用，表现为大鼠睾丸重量明显增加，睾丸组织形态恢复，精原干细胞增殖加快以及精子数量显著提高。本研究结果也发现，与GTW 组比较，LBP+GTW 组大鼠的体质量、睾丸质量均升高。病理结果显示，与C 组比较，GTW组的曲细精管扭曲、水肿；曲细精管间距增宽；精原细胞、精母细胞明显减少，而LBP+GTW 组的病理损伤明显轻于GTW 组。提示LBP 可以拮抗GTW 所导致的睾丸组织病理改变。

NF-kB 信号通路是体内一条非常经典的信号通路，参与细胞的生存、增殖和分化等相关基因的表达调控，在细胞凋亡的过程中发挥重要的作用[12]。Bcl-2 作为NF-kB 通路下游的重要靶点之一，是目前公认的细胞凋亡调控机制中的关键蛋白，是参与细胞凋亡的主要抑制基因，高表达的Bcl-2 蛋白可抑制细胞凋亡进程，延长细胞寿命。研究表明，在早孕期，NF-kB 信号通路可能被激活以此调节胚泡着床和妊娠期重要分子的表达；也可能被下调表达，发挥妊娠过程中的免疫抑制作用[13]。此外，刘辉等[14]发现：睾丸扭转复位诱导NF-kB 激活，之后进入生殖细胞核内调控Bax 表达水平、Bcl-2 表达水平降低，导致Bax 与Bcl-2 比值升高，从而引起生殖细胞的凋亡。提示NF-kB 信号通路与生殖功能存在密切关联性。因此本实验是基于NF-kB 信号通路所进行的实验研究。

NF-kB 蛋白通常以NF-kB/Rel 家族组成同源或异源复合物的形式存在，最常见的是p50/p65 异二聚体，也是其活性的主要形式。细胞在静息状态下，细胞质中的p50/p65 与其抑制物IkB结合成三聚体，使不能核易位。IkB 激酶主要由两个催化亚基IKKα、IKKβ 和一个调节亚基IKKγ组成。当细胞受到细胞外信号刺激时，IKKβ 亚基被磷酸化激活，继而引起IkBα 被磷酸化，磷酸化后的IkBα 降解，释放的p50/p65 进行核易位，与基因上的kB 位点发生特异性结合，从而发挥调节细胞功能的作用。因此，本实验通过Western blot检测IKBα、p65、p-p65 以及Bcl-2 蛋白表达，旨在从NF-kB 信号通路探讨LBP 拮抗GTW 生殖损伤的作用机制。本次实验结果表明，与C 组比较，GTW 组p65、p-p65 蛋白表达水平均升高，IKBα、Bcl-2 蛋白表达水平均降低；LBP+GTW 组p65、p-p65、Bcl-2 蛋白表达水平均升高，IKBα 蛋白表达水平降低。提示LBP＋GTW 组和GTW 组大鼠睾丸中NF-kB 信号通路处于激活状态。LBP可能通过提高Bcl-2 的表达水平，以此拮抗GTW的生殖损伤作用。

综上所述，LBP 可以促进GTW 所导致的生殖损伤修复其作用机制可能是上调睾丸组织中p65、p-p65 以及Bcl-2 表达水平，激活NF-kB 信号通路来抑制该生殖损伤作用的发生。