生物药肥对水稻秧苗免疫抗病机理的研究

2020-07-01高文逸戴航宇

东北农业大学学报 2020年6期

丁伟，高文逸，程茁，戴航宇

(1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

水稻是中国重要粮食作物。20世纪80年代，黑龙江省开始大面积推广水稻旱育稀植技术，水稻单产水平不断提高[1]。目前化学壮秧剂在水稻育秧过程中大量应用，化学壮秧剂由调酸剂、无机肥料和化学杀菌剂复配而成，调酸剂大多为工业浓硫酸，不仅生产过程具有危险性，且应用过程也对水田生态环境造成严重污染[2]。生物药肥是将有益功能微生物与作物所需养分结合，在生产上可防治有害生物，满足作物生长发育养分需求。国内外该领域相关研究处于起步阶段，目前国内尚无生物药肥国家或行业标准。因此，研发环境友好的生物药肥替代化学壮秧剂成为该领域研究热点。

农业生产中，利用植物免疫作用减少化学农药施用量，对解决环境污染问题具有重要意义。自从《Nature》报道植物本身存在有效免疫系统后[3]，国内外免疫相关研究迅速发展，使诱导植物抗病性进入实用化阶段。传统农药仅针对特定病害，忽视植物对病原菌抵抗能力。可利用外源植物免疫物质激发植物免疫系统，诱导植物产生广谱抗病、抗逆能力，调节植物体内代谢系统、促进植物生长。外源植物免疫物质一般分为两类：一是植物免疫诱导子，包括：蛋白、寡糖、生物代谢产物或有机活性小分子；二是植物免疫诱导菌，包括：木霉菌、芽孢杆菌等[4]。植物免疫诱导菌指菌体或其代谢产物可激发植物免疫系统，使植物获得抗病及抗逆性能的微生物。利用植物免疫诱导菌生长过程中产生的多种活性物质抑制病原菌生长，刺激植株产生抗病因子，诱导植物产生免疫反应，可防治多种植物病害[5-6]。

为解决水稻旱育苗过程中立枯病这一难点问题，本文将枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和青霉与矿质营养复配成生物药肥并用于苗床育秧，测定水稻生长、土壤养分变化及秧苗抗逆酶活性，为利用生物药肥诱导水稻秧苗免疫抗病替代化学农药提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、青霉（Penicillium）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由东北农业大学农学院农药学科保存并提供。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：葡萄糖12 g，琼脂10 g，马铃薯120 g，用蒸馏水定容至1 000 mL，充分溶解后121℃灭菌30 min。

NA培养基：蛋白胨6 g，牛肉膏5 g，NaCl 4 g，琼脂粉20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，调整pH 7.2，充分溶解后121℃高温灭菌30 min。

无机磷真菌液体培养基：NaCl 0.3 g，KCl 0.4 g，(NH4)2SO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.02 g，Ca3(PO4)24.0g，葡萄糖10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0，121℃高温灭菌30 min。

无机钾真菌液体培养基：FeCl30.004 g,Na2HPO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，CaCO30.1 g，钾长石粉5 g，葡萄糖5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，调整pH 7.0，充分溶解后121℃高温灭菌30 min。

无机磷细菌液体培养基：NaCl 0.2 g，CaCO32.3 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，MnSO4·H2O 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，Ca3(PO4)210 g，葡萄糖3 g，蒸馏水定容至1 000 mL，调整pH 7.0，充分溶解后于121℃高温灭菌30 min。

无机钾细菌液体培养基：Na2HPO41.6 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，(NH4)2SO40.4 g，钾长石粉 5 g，（琼脂20 g），蔗糖5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，调整pH 7.0，充分溶解后121℃高温灭菌30 min。

1.2 室内试验

1.2.1 供试菌株纯化培养

取4℃冰箱内保存供试菌3株，分别放置于PDA和NA平板中央，倒置培养4～5 d，挑取供试菌株置于PDA和NA平板上进一步纯化培养。

1.2.2 液体培养条件下解磷和解钾能力测定

取供试3个菌株培养液10 mL用4层纱布过滤，转移至离心管离心10 min，弃掉上清液加蒸馏水10 mL充分溶解后再次离心，弃掉上清液后将沉淀放入50 mL无菌水中，振荡20 min使孢子散开。取充分散开孢子悬浮液滴入血球计数板后显微镜下计数，调整浓度直到获得浓度为108cfu·mL-1孢子悬浮液。将制备孢子悬浮液按5%接种量接种于装有200 mL难溶钾矿石粉和难溶磷矿石粉液体培养基中，160 r·min-1振荡培养。分别于培养0、2、4、6和8 d时取样品20 mL，离心后取上清液测定样品中可溶性钾和磷含量。

1.3 田间试验

试验于2017～2018年在东北农业大学校内园艺实验站内完成，供试水稻品种为龙粳47号。4月10～15日播种，共设6个处理，见表1。水稻旱育苗小区面积为8 m2，4次重复。种子催芽后播种，采用机插盘旱育秧，育秧盘规格为：30 cm×60 cm，育秧土过筛后，按设计用量分别把供试菌株与N、P、K养分复配，与过筛育秧土混拌均匀，每盘装混拌育秧土1.5 kg并浇透底水，每盘播催芽种子50 g，再用育秧土1 kg均匀覆盖育秧盘表面。

表1 试验处理及生物药肥中菌液用量Table 1 Test treatment andbacterial fluid dosage in bio-fertilizer

1.3.1 秧苗素质测定和立枯病调查

水稻秧苗4叶期取样，每处理取100株完整秧苗，清水洗净根系，吸水纸吸干水分，测定幼苗茎基部宽度、株高、百株秧苗地上和根系鲜重及干重。采用游标卡尺测定茎基部宽度，采用烘干法测定干重，先在105℃下杀青30 min，调整温度为60℃烘干至恒重。

水稻2叶期后是立枯病发病高峰期期。在水稻3叶期，调查试验地立枯病，采用对角线5点取样法，每点调查100株，立枯病发病率计算公式如下。

1.3.2 苗床土壤抗逆酶活性测定

在水稻2叶和4叶期取样调查，取水稻幼苗完全展开叶片，分别测定SOD、POD酶活性，Pro、MDA含量，分别参照比色法[7]，愈创木酚比色法[8]，硫代巴比妥酸比色法和磺基水杨酸法[7]。

1.3.3 土壤养分测定

在播种前、水稻2叶和4叶期取苗床育秧土风干并过筛，测定土壤中碱解氮、速效磷和速效钾含量，测定方法分别采用碱解扩散法[9]、钼蓝比色法和火焰光度计法。

1.4 数据处理与分析

试验原始数据采用Excel 2013软件整理，应用DPS 9.01统计软件分析数据5%水平差异显著性。

2 结果与分析

2.1 菌株解磷和解钾作用

青霉解磷能力随时间延续而增强，上清液中可溶性磷含量在4 d时达最大值，377 μg·mL-1。哈茨木霉在培养6 d时可溶性磷含量达峰值，166.10 μg·mL-1，此后上清液中被供试菌株分解释放的可溶性磷含量降低。枯草芽孢杆菌具有一定解磷能力，但显著低于青霉和哈茨木霉。

3个菌株培养基中可溶性钾含量随时间推移均逐渐增加。第10天，枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和青霉菌液中可溶性钾含量达到最大值，分别为58.43、39.20和38.06 μg·L-1，解钾能力表现为：枯草芽孢杆菌＞木霉=青霉（见表2）。

表2 菌株解磷和解钾效果Table 2 Effects of bacterial strain on phosphorus and potassium release

2.2 生物药肥对水稻苗床土壤养分的影响

测定周期内碱解氮和速效钾含量呈下降规律，速效磷含量呈先增后降趋势。水稻2叶和4叶期，木霉+青霉+枯草芽孢杆菌处理碱解氮含量与对照相比提高12.5%，除青霉处理外，均显著高于其他处理。2叶期，生物药肥各处理速效磷含量比对照提高39.7%～118.9%。4叶期，速效磷含量开始降低，但木霉+青霉+枯草芽孢杆菌复配处理速效磷含量仍高于对照53.4%。2叶期，生物药肥各处理与对照相比速效钾含量提高15%～40.9%，4叶期，以木霉+青霉+枯草芽孢杆菌处理速效钾含量最高（见表3）。生物药肥显著提高土壤碱解氮、速效磷和速效钾含量，以木霉+青霉+枯草芽孢杆菌复配的生物药肥效果最优（见表3）。

表3 生物药肥对水稻苗床土壤养分的影响Table 3 Effects of bio-fertilizer on soil nutrients in rice seedling culture bed

2.3 生物药肥对水稻秧苗素质的影响

生物药肥显著增加水稻秧苗茎基部宽度，以木霉+青霉+枯草芽孢杆菌复合菌复配生物药肥施用后水稻秧苗茎基部宽度最大，较对照增加11.5%。生物药肥各处理株高与对照间差异不显著。生物药肥各处理均显著增加水稻幼苗地上和根系鲜重和干重，以木霉+青霉+枯草芽孢杆菌复合菌复配生物药肥显著高于单一菌株复配生物药肥（见表4）。

2.4 生物药肥对水稻秧苗抗逆酶的影响

生物药肥显著提高SOD和POD活性及Pro含量，降低MDA含量。但施用单一菌株复配生物药肥后，在水稻秧苗2叶和4叶期，SOD和POD活性，Pro含量均显著低于复合菌株复配生物药肥处理，MDA含量则显著升高。其中木霉+青霉+枯草芽孢杆菌复合菌复配生物药肥处理效果最优（见表5）。

2.5 生物药肥对立枯病发病率的影响

2017年生物药肥各处理立枯病发病率均显著低于对照，但复合菌株复配生物药肥立枯病发病率显著低于单一菌株复配生物药肥处理，其中枯草芽孢杆菌+哈茨木霉和木霉+青霉+枯草芽孢杆菌复合菌株复配生物药肥效果最好，无立枯病发生。2018年立枯病严重，各生物药肥处理立枯病发病率均显著低于对照，复合菌株复配生物药肥立枯病发病率最低，对立枯病防治效果显著，其中木霉+青霉+枯草芽孢杆菌复合菌复配生物药肥处理效果最优，立枯病发病率仅为2%（见表6）。

表4 生物药肥对水稻秧苗素质的影响Table 4 Effects of bio-fertilizer on the quality of rice seedlings

表5 生物药肥对水稻秧苗抗逆酶的影响Table 5 Effects of bio-fertilizer on stress resistance enzyme in rice seedlings

表6 生物药肥对立枯病的影响Table 6 Effects of bio-fertilizer on the rice seedling blight

3讨论

生物药肥优势在于集合多种植物免疫诱抗菌并与矿质养分复配，既保证水稻苗期所需营养，又发挥植物免疫诱抗菌抗病机制，更大限度发挥促生作用并提高抗病性，为水稻高产奠定良好基础。相关研究发现，枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和青霉产生多种活性物质，对多种病原菌具有抑制作用[5-6]。枯草芽孢杆菌可产生细菌素、酶类、活性蛋白类和多肽类等物质，主要防治对象为丝状真菌引起的植物病害，如水稻纹枯病（Stagonospo⁃ra curtisii）、番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）、大豆根腐病（Fusarium graminerarum）、棉花立枯病(Rhizoctonia solani）。哈茨木霉在代谢过程中可产生多种抑制病原菌的活性物质，如抗菌肽、吡喃酮类抗生素等[10]。青霉菌活性次生代谢产物主要有青霉素类抗生素、生物碱类、蒽醌类和菌素类等[11-12]，均具有抑制病原菌作用。枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和青霉不仅抑制植物病原菌，还释放诱发植物局部和系统防御反应的化合物，诱导植物增强抗病性。枯草芽孢杆菌FZB24既产生与植物抗性蛋白合成基因表达相关的信号蛋白诱导植物抗性，也分泌相关蛋白如丝氨酸专性肽链内切酶直接诱导植物抗性[13]。哈茨木霉产生多种具有诱导作用的活性物质，如萜类化合物、酚衍生物、抗毒素、类黄酮、糖苷配基等。接种哈茨木霉和尖孢镰刀菌的黄瓜植株中CAD、PPO、G-POD、CA-POD和CGA-POD活性显著提高[14]。青霉菌诱导植株产生系统性抗病性，促进植株体内病程相关蛋白基因表达。青霉灭活菌丝体及其代谢产物诱导烟草POD和PPO活性提高，对烟草黑胫病具有显著诱导抗病作用[15]。本研究发现，施用枯草芽孢杆菌+哈茨木霉+青霉复合菌复配生物药肥后，诱导水稻秧苗抗逆酶活性显著高于单一菌株，这是利用复合菌株复配生物药肥降低立枯病发病率的一个重要原因。

枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和青霉可产生生长调节物质，促进植物幼苗和根系生长发育，增强植物抗病性，间接减少病害发生。用枯草芽孢杆菌FZB24(r)处理后黄瓜根系显著提高，且FZB24(r)液体培养物中还存在植物生长素及类似代谢物如细胞分裂素、脱落酸、赤霉酸等，对多种植物具有促生作用[14]。研究发现哈茨木霉发酵液中存在奈乙酸、吲哚乙酸和赤霉素类活性物质，且经哈茨木霉发酵液处理后，显著提高白菜、菠菜和辣椒鲜重及叶绿素含量，促进作物生长发育。本研究结果表明，施用生物药肥后，提高水稻秧苗茎基部宽度、地上部和根系鲜重、干重，水稻秧苗生长健壮，可提高水稻秧苗抗病性。

水稻是以收获籽粒为目标的农作物，苗期生长情况直接影响后期生长。水稻苗期仅靠土壤中养分供给无法满足苗期生长发育[16]。水稻播种前施足氮、磷、钾养分，对促进根系发育，保障秧苗正常生长和增强抗病性发挥作用[17-18]。相关研究发现，枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和青霉可通过产生有机酸、酶类或是荚膜多糖等，溶解土壤中难溶性养分，提高土壤有机质、速效磷、速效钾和碱解氮含量[19-20]。本文供试微生物可分解释放难溶磷和钾，在施用生物药肥后，尤其是复合菌株复配生物药肥显著提高土壤碱解氮、速效磷和速效钾含量，通过促进土壤养分释放，使水稻秧苗健壮生长，进而增强秧苗对立枯病抗病能力。