云南省师宗县蚊虫中版纳病毒核酸检测及其序列分析

吕顺燕，李楠，何于雯，孟锦昕，杨绍昌，3，王静林*

(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224；2.昆明市东川区动物疫病预防控制中心，云南 昆明 654100；3.双江县畜牧兽医技术推广中心，云南 双江 677399)

云南省位于我国的西南部，与虫媒病毒高流行地区东南亚多个国家直接接壤，气温高，降雨量丰富，是我国存在蚊虫种类和发现虫媒病毒种类最多的省份[1,2]。1987年首次在云南省西双版纳州具有不明原因发热、脑炎患者的脑脊液和血清标本中分离到一种新的12节段病毒，根据病毒分离地点命名为版纳病毒(Banna virus，BAV)[3]。随后证实了版纳病毒广泛分布于印度尼西亚、越南、老挝[4-6]等东南亚国家以及中国甘肃、山西、山东、辽宁、内蒙古、湖北等多个地区[7]。由于多次直接从病人标本中分离到版纳病毒，并在不明原因发热和病毒性脑炎患者血清中筛查到版纳病毒IgM和IgG抗体[2]，这些研究结果表明了版纳病毒可能是一种引起人类发热和病毒性脑炎的重要新发传染病的病原体，引起了国内外病毒学家和疾病预防控制专家的广泛关注[8]。因此，为了解云南省师宗县BAV传播媒介蚊虫种类及携带版纳病毒分子特征，本研究采用BAV 12节段特异引物对2013年在云南珠江上游地区采集的蚊虫标本进行BAV核酸检测，并对蚊虫携带的BAV 12节段基因进行序列测定和分析，为该地区虫媒病毒的研究以及当地相关人或动物虫媒病毒病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 蚊虫标本来源

2013年7月，在云南省师宗县五龙乡水寨村、下鲁木村和高良乡鲁古村、舍里村4个村居民区附近的牛圈和猪圈，采用灯诱方法采集蚊虫标本，在体视显微镜下根据蚊虫形态学特征对采集的蚊虫进行分类鉴定，共采集到库蚊、按蚊、伊蚊、Lufzia和阿蚊5个属的7种蚊虫3705只，分88批进行研磨[9]，-85℃保存备用。

1.2 病毒RNA提取和第一链cDNA合成

取蚊虫研磨悬液200μL采用RNAiso Plus (Takara，大连宝生物) 按照说明书提取总RNA，最后用20μL无RNase的DEPC处理水溶解RNA。采用PrimeScript Reverse Transcriptase反转录试剂(Takara 大连宝公司) 按说明书合成cDNA第一链。

1.3 PCR扩增和克隆

采用版纳病毒第12片段特异引物(12-854-S：AAATTGATAGYGYTTGCGTAAGAG；12-B2-R：GTTCTAAATTGGATACGGCGTGC)[10]对2013年在云南省师宗县采集的88批蚊虫样本进行扩增，PCR反应体系为20μL，即cDNA 2μL、 10×Buffer 2μL、 2.5mmol /L dNTP 2μL、上(12-854-S)下(12-B2-R)游引物各0.5μL、exTaq酶0.3μL、去离子水12.7μL，充分混匀，94℃预变性5min、94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 60s，35个循环，72℃延伸10min，1%琼脂糖电泳检查扩增条带，PCR扩增阳性产物送擎科生物工程技术有限公司(昆明)进行测序。

1.4 序列分析

使用MEGA X软件中ALIGN进行病毒基因序列和推测的氨基酸序列比对，使用DNASTAR软件中MegAlign进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。使用MEGA X 软件完成基于Neighbor joining (NJ) 方法构建系统进化树，bootstrap值为1000。

2 结果

2.1 版纳RT-PCR检测结果

采用版纳病毒12节段特异引物对2013年在云南省师宗县采集的5个属7种蚊虫88批进行扩增，其中1批三带喙库蚊(SZ32)扩增到856bp大小电泳条带，提示该批蚊虫版纳病毒扩增阳性，其余87批蚊虫样本扩增均为阴性(见图1)，蚊虫版纳病毒批阳性率为1.14%(1/88)。

N.阴性对照；1-7.SZ25-SZ31；8.SZ32；9-23.SZ33-SZ47；M.Marker 2000bp。

图1 云南省师宗县采集88批蚊虫标本BAV12节段特异引物RT-PCR电泳结果

2.2 云南省师宗县三带喙库蚊携带版纳病毒遗传进化分析

对SZ32 RT-PCR扩增产物测序获得版纳病毒12节段序列849核苷酸(nt)，与15株不同地区分离版纳病毒和其他4株东南亚十二节段双链RNA病毒属(Seadornavirus)代表毒株相应序列一起构建系统进化树，采用MEGA X 软件中NJ方法构建(见图2)，结果显示云南省师宗县蚊虫中检测到的SZ32与所有不同地区分离15株版纳病毒位于同一个进化分支内；在系统进化树上所有版纳病毒形成两个较大的进化分支，即A基因型进化分支和B基因型进化分支，A基因型进化分支包括了中国以及越南流行的版纳病毒，B基因型包括在印度尼西亚流行的病毒株；进一步分析发现A基因又分为A1和A2两个基因亚型进化分支， A1基因亚型包括我国北方地区甘肃、山西、辽宁等地流行的病毒，A2基因亚型进化分支包括了云南和越南流行病毒，本次在云南省师宗县蚊虫中携带的版纳病毒位于A1基因亚型进化分支内。

● 为本研究新分离病毒株

图2 云南省师宗县三带喙库蚊携带版纳病毒12节段(810nt)序列系统进化分析(NJ法)

2.3 云南省师宗县三带喙库蚊携带版纳病毒核苷酸和氨基酸同源性分析

云南省师宗县三带喙库蚊SZ32携带的病毒与版纳病毒核苷酸同源性在82.5%～98.4%，氨基酸同源性在89%～98.7%，而与Seadornavirus其他4种病毒核苷酸同源性均低于52.4%，氨基酸同源性低于36.8%；SZ32与A基因型BAV核苷酸同源性在89.7%～98.4%，氨基酸同源性在90.8%～98.7%，而与B基因型BAV核苷酸同源性仅为85%，氨基酸同源性为89%；进一步分析SZ32与A2基因型BAV核苷酸同源性在93.7%～98.4%，氨基酸同源性在95.6%～98.7%，而与A1基因型BAV核苷酸同源性为89.7%～91.3%，氨基酸同源性为90.8%～93.4%，见表1。

表1 云南省师宗县蚊虫携带BAV与其他BAV和Seadornavirus核苷酸和氨基酸同源性分析

-：没有进行分型。

3 讨论

1987年首次从云南省西双版纳病人标本中分离到病毒以来[2]，相继在位于北温带、亚热带以及热带(赤道至北纬42度)的中国、印度尼西亚、越南等国家分离到多株版纳病毒[4-7]。本次研究采用版纳病毒12节段特异引物对2013年7月在云南省师宗县采集的5属7种蚊虫88批进行核酸检测，其中一批蚊虫(SZ32)扩增阳性，序列分析结果显示SZ32与所有不同地区分离15株版纳病毒位于同一个进化分支内，核苷酸和氨基酸同源性分别在82.5%～98.4%、89%～98.7%，提示师宗县蚊虫携带的SZ32为版纳病毒。由于版纳病毒地理分布具有明显的地域性特征，分为基因A型和基因B型两个基因型，基因A型又分为由北方分离株组成的A1亚型和南方分离株组成的A2亚型[7]。本次在云南省师宗县蚊虫中携带的版纳病毒与云南省以前流行的和越南等地区流行的BAV位于同一个小的进化分支内，A1基因亚型分支，核苷酸和氨基酸同源性也较高，分别在93.7%～98.4%、95.6%～98.7%。而与我国北方地区甘肃、山西、辽宁等地流行的A2基因亚型版纳病毒位于不同进化分支，核苷酸和氨基酸同源性分别低于91.3%、93.4%。提示本次在云南省师宗县蚊虫中检测的版纳病毒为A1基因型版纳病毒。

版纳病毒被认为是一种引起人类发热和病毒性脑炎的重要新发传染病的病原体或潜在病原体[8]。该病毒多次从发热脑炎病人、牛以及蚊虫、蜱、蠓虫等媒介昆虫中分离到，特别近年来从蚊虫中分离的病毒株数量最多，已在我国多地区采集的3属10种蚊虫中分离到多株版纳病毒。此次在云南省师宗县采集的三带喙库蚊中检测到该病毒，该蚊种是当地牛圈、猪圈主要优势蚊种，也是云南省以及我国其他多个地区优势蚊种。提示三带喙库蚊可能是版纳病毒主要传播媒介之一，版纳病毒在云南省乃至我国其他多个地区的蚊虫媒介中可能广泛存在。本研究为了解云南省携带版纳病毒传播媒介种类，探讨蚊虫携带版纳病毒遗传进化关系及基因型基因亚型分布，为进一步了解版纳病毒生态学和相关虫媒病毒病预防控制提供科学依据。