西藏环状病毒RT-PCR检测方法的建立

元正菊，李楠，何于雯，孟锦昕，王静林

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

西藏环状病毒 (Tibet orbivirus, TIBOV)属于环状病毒属,该病毒2009年于我国西藏自治区林芝市墨脱县采集的蚊虫标本圆斑按蚊中首次分离到[1],随后在广东致倦库蚊 (D181/2008)[2]和云南蠓虫标本中分离到西藏环状病毒 (YN12246和DH13C120)[3，4]。在云南省多个地区采集到的牛、羊血清标本中检测到西藏环状病毒的中和抗体,并在双份血清中存在4倍以上中和抗体的升高, 在江城和德宏等边境地区牛西藏环状病毒中和抗体阳性率较高，表明云南省家养动物(牛、羊)广泛存在西藏环状病毒感染，西藏环状病毒可能是当地家养动物不明原因发热甚至流产的潜在致病病原, 可能对当地家养动物的健康带来一定危害[4]，但目前缺乏TIBOV核酸检测方法。鉴于此，本研究根据云南省新分离的TIBOV DH13C120株Seg-7片段序列设计1套巢式引物，优化反应体系和条件，建立一种高效、灵敏、特异的用于检测TIBOV的巢式RT-PCR方法，并对不同时间不同地区分离的 9株TIBOV进行检测，准确地对TIBOV感染做出诊断，为TIBOV的临床检测及流行病学调查提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 研究背景及来源

MJC1-1、DH13C120、JCC12-9、JCC12-12、JCC11-5、JCC28-2、MJ1-3、MJ1-1、JC-7等9株病毒分离自2013—2018年云南省采集的蠓虫和蚊虫，经分子生物学鉴定为TIBOV；JCC12-7株病毒分离自2018年云南省采集的蠓虫，经分子生物学鉴定为蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)，JCC673株分离自2013年云南省采集的库蠓，经分子鉴定为鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)，以上11株病毒鉴定后-85℃冰箱保存备用。BTV4标准株由国外引进后在本实验室传代保存。

1.2 病毒稀释和阴性对照

从-85℃冰箱取出MJC1-1、DH13C120、JCC12-9、JCC12-12、JCC11-5、JCC28-2、MJ1-3、MJ1-1、JC-7、JCC12-7、JCC673和BTV4标准株等12株病毒，用细胞培养液(pH 7.4 MEM培养基)稀释病毒细胞培养液，病毒液终浓度为100 TCID50。采用细胞培养液为阴性对照。

1.3 引物

根据云南省新分离TIBOV DH13C120株Seg-7片段序列(KU754032)采用Primer 5.0设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物的靶基因、位置、序列和扩增产物的大小见表1。

表1 西藏环状病毒Seg-7片段巢式RT-PCR检测引物信息

1.4 病毒RNA提取

采用RNAiso Plus试剂 (TaKaRa，中国大连)，按照试剂盒说明书操作提取病毒RNA。简单步骤如下：分别取出稀释好的(终浓度为100 TCID50)MJC1-1、DH13C120、JCC12-9、JCC12-12、JCC11-5、JCC28-2、MJ1-3、MJ1-1、JC-7和JCC12-7等10株病毒上清液以及阴性对照培养液各200μL于1.5mL离心管中，再分别加入800μL RNAiso Plus，剧烈振荡混匀15s，静止20min；加入200μL三氯甲烷，振荡混匀15s，静置15min；12000r/min，4℃离心15min，取600μL上层水相转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇(-20℃预冷)，轻轻颠倒混匀，静置20min；12000r/min，4℃离心15min，弃上清液，加入75%乙醇1mL洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液；干燥RNA沉淀后加入100μL DEPC处理过的水溶解。立即进行RT-PCR反应或-80℃保存。

1.5 反转录

采用Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)试剂盒(TaKaRa，中国大连)，按照说明书进行cDNA的合成。RNA/引物混合液：提取的RNA 8μL，随机六聚体引物pd(N)6 1μL，10mM dNTP Mixture 1μL，混匀，65℃ 10min，立即置于冰浴中2min；反转录反应液：5X Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)(200U/μL) 0.5μL，RNase free H2O 4.5μL，上述模板 RNA/引物变性溶液 10μL，轻敲管壁以混匀反应体系，短暂离心；反应条件：30℃ 10min，42℃ 1h，70℃ 15min。将cDNA储存于-20℃条件。

1.6 PCR扩增反应

以2.5μL cDNA为模板，在反应体系中依次加入Premix Taq(Ex Taq Version 2.0)12.5μL、引物120S7F1(20pmol/μL)、120S7R1(20pmol/μL)各0.5μL、用双蒸水补足体积至25μL，充分混匀。PCR反应条件：首先94℃ 预变性5min； 94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 70s，35个循环；最后72℃延伸10min。以1μL PCR产物为模板，在反应体系中依次加入Premix Taq(Ex Taq Version 2.0)12.5μL、引物120S7F2(20pmol/μL)、120S7R2(20pmol/μL)各0.5μL、用双蒸水补足体积至25μL，充分混匀。巢式PCR反应条件：首先94℃ 预变性5min； 94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 35s，35个循环；最后72℃延伸10min。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

2 结果

2.1 西藏环状病毒方法建立

根据云南省新分离TIBOV DH13C120株Seg-7片段序列设计1套巢式引物，外引物为120S7F1/R1，退火温度为52℃，扩增片段大小为1050bp；内引物为120S7F2/R2，退火温度为54℃，扩增片段大小为500bp。用DEPC水溶解、稀释，终浓度为20 pmol/μL。先用外引物120S7F1/R1对TIBOV DH13C120株和蓝舌病毒 JCC12-7进行第一轮扩增，设1个阴性对照，用第一轮PCR扩增作为模板，采用内引物120S7F2/R2进行第二轮扩增，结果TIBOV DH13C120株第一轮扩增在1050bp处观察到电泳条带，第二轮扩增在500bp处观察到电泳条带，而蓝舌病毒JCC12-7和阴性对照两轮均未扩增到目的条带，见图1。

1-3.一次PCR扩增产物(120S7F1/R1)；4-6.二次PCR扩增产物(120S7F2/R2)。M.2000 bp；1.DH13C120; 2.JCC12-7; 3.阴性对照；4.DH13C120; 5.JCC12-7; 6.阴性对照。

图1 DH13C120西藏环状病毒Seg-7片段巢式RT-PCR扩增结果

2.2 对9株TIBOV巢式RT-PCR检测

分别采用外引物(120S7F1/R1)、内引物(120S7F2/R2)对9株TIBOV(MJC1-1，MJ1-2，JCC12-9，JCC12-12，JCC11-5，JCC28-2，MJ1-3，MJ1-1，JC-7)、2株蓝舌病毒(JCC12-7和BTV4标准株)和1株鹿流行性出血热病毒(JCC673)进行扩增，检测结果见图2。9株TIBOV第一轮扩增和第二轮扩增分别在1050bp和500bp处观察到目的条带，提示TIBOV扩增均为阳性(表2)，而蓝舌病毒JCC12-7株、BTV4标准株和鹿流行性出血热病毒JCC673株两轮均未观察到目的条带，提示扩增阴性，见图2。以上结果再次表明了该方法能够用于目前流行TIBOV核酸检测。

表2 9株TIBOV巢式RT-PCR检测

注：“+”为PCR扩增阳性；“-”为PCR扩增阴性；BTV：蓝舌病毒；EHDV：鹿流行性出血热病毒。

a：一次PCR扩增产物(120S7F1/R1)。M.2000bp DNA Marker；1.MJC1-1；2.MJ1-2；3.JCC12-9；4.JCC12-7；5.JCC12-12； 6.JCC11-5；7.JCC28-2； 8.MJ1-3；9.MJ1-1；10.JC-7；11.BTV；12.EHDV；13.H2O。 b：二次PCR扩增产物(120S7F2/R2)。M.2000bp DNA Marker；1.MJC1-1；2.MJ1-2；3.JCC12-9；4.JCC12-7；5.JCC12-12； 6.JCC11-5；7.JCC28-2； 8.MJ1-3；9.MJ1-1；10.JC-7; 11.BTV；12.EHDV；13.H2O。

图2 TIBOV Seg-7设计引物扩增结果

3 讨论

环状病毒具有广泛宿主动物, 包括家养及野生反刍动物、有袋目哺乳动物、马、蝙蝠、树獭、鸟类和人类[5]，以蠓、蚊、白蛉、蜱等为传播媒介。环状病毒属中包含多种重要的可导致动物疾病的病毒, 如通过库蠓等传播的BTV, 可引起羊等反刍动物出血性疾病[6];通过库蠓等传播的非洲马瘟病毒可以造成马匹严重的心血管疾病及肺部疾病, 该病毒在地中海地区 (特别是北非和南欧) 曾多次流行, 给马匹的生长和饲养带来巨大危害[7];通过库蠓等传播的EHDV造成北美的白尾鹿等家养和野生有蹄类动物出现血管损伤等类似蓝舌病的症状[8]。此外, Palyam病毒、秘鲁马病病毒等也是重要的致动物流行性疾病的病毒[4]。近年来，在我国西藏、云南、广东等地分离到多株TIBOV，经序列分析发现TIBOV病毒是蠓传病毒，与对家养动物致病性较高的BTV关系密切，而且在当地牛羊中存在较高的TIBOV感染率，且病毒感染滴度较高，提示TIBOV可能是对家养的牛羊致病或潜在致病的病原，需要建立一种准确、快速检测西藏环状病毒的方法，加强开展家养动物的TIBOV监测与检测。本研究根据云南省新分离TIBOV DH13C120株第七节段保守区设计一套巢式引物建立了巢式RT-PCR检测方法，TIBOV DH13C120株第一轮和第二轮均扩增出与预期设计相一致的目的条带，而BTV JCC12-7株和阴性对照两轮均未扩增到目的条带，提示该引物可以用于TIBOV的核酸检测。为了进一步检验该引物是否能用于更多TIBOV检测，采用该方法对云南省新分离的9株TIBOV、2株BTV和1株EHDV进行检测，9株TIBOV扩增均为阳性，而BTV、EHDV和阴性对照均为阴性，提示根据TIBOV DH13C120株第七节段保守区设计引物建立的巢式RT-PCR方法能用于云南省目前动物或媒介中流行的TIBOV核酸检测。

巢式RT-PCR克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大地提高了PCR的敏感性；而内侧引物扩增模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段的反应，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，可以保证整个反应的准确性。因此，本研究设计了一套外引物和内引物进行巢式RT-PCR扩增，提高检测方法的灵敏度和准确性；此外，本研究在建立方法时还采用同属而且遗传进化关系较为密切的蓝舌病毒JCC12-7株、BTV4标准株和鹿流行性出血热病毒JCC673株作为病毒对照，同时设有阴性对照，保证了反应的特异性。在本研究中这些样品两轮扩增均为阴性，结果表明该方法具有较好的特异性，可用于家养动物西藏环状病毒感染的诊断，为西藏环状病毒的临床检测及流行病学调查提供有效手段，对虫媒病的防治具有重要意义。