云南鸡源副禽嗜血杆菌的分离鉴定与耐药性分析

严红亚，李廷翠，，李珂，赵蓉，字吉祥，常志顺，信爱国*

(1．云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，云南 昆明 650224；2.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

副禽嗜血杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)，即副鸡嗜血杆菌( Haemophilus paragallinarum，Hpg)，又称为鸡传染性鼻炎(Infectiuns coryza，IC)，为革兰氏阴性杆菌，该菌对生长环境要求较高，大部分菌株都有NAD(辅酶I)依赖性[1]。鸡感染副禽嗜血杆菌后，临床大多会出现眼睛肿胀，鼻腔和鼻窦有浆液性或黏液性分泌物，面部水肿和结膜炎，肉垂出现明显肿胀等特征。近年来，我国集约化养鸡业蓬勃发展，此病的发病率呈上升趋势。该病主要集中流行于繁殖鸡和蛋鸡，其他禽类也有感染该病的报道[2]。该病的发生一般是受饲养环境条件、营养水平、气候变化等因素影响，不同日龄鸡群混养常常导致该病的爆发。本文对2019 年春季送检的临床疑似副禽嗜血杆菌感染的家禽病例进行临床诊断和病理剖检，采集病样进行细菌分离鉴定，确诊为副禽嗜血杆菌感染。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2019年3月采集自云南省某规模化养殖场发病鸡群，主要表现为流鼻涕、面部肿胀、鼻腔与窦腔黏膜发炎，产蛋率下降，临床诊断疑似副禽嗜血杆菌感染。

1.2 主要试剂

普通营养琼脂、血琼脂、1%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)血琼脂培养基按常规方法制备，SS琼脂、麦康凯琼脂购自北京奥博兴生物科技有限公司。革兰氏染液、细菌微量生化反应管、抗生素药敏纸片购自杭州天河微生物试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker DL2000等购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 细菌分离鉴定

无菌棉签深入病死鸡鼻窦腔深部无菌采集病料，画线接种在血琼脂、1% NAD血琼脂培养基上，37℃ 5%二氧化碳恒温培养箱中培养24h；接种环无菌采集肝、肺等器官分别画线接种在血琼脂培养基上，37℃恒温培养24h，观察细菌的生长状况。挑取单个菌落革兰氏染色、镜检，观察形态。对分离菌株进行单菌落划线培养纯化后，对分离菌株进行生理生化鉴定[3]。

1.4 细菌血凝活性测定

用灭菌 PBS(pH 7.2 0.01 mol/L)清洗F3代纯化培养细菌菌落，离心收集菌落，洗涤3次，通过比浊法将细菌浓度调节至1×1010CFU/mL，反复冻融3次后作为待测抗原[4]。通过常规方法检查其鸡红细胞的凝集活性。

1.5 细菌基因组DNA提取和PCR扩增

细菌基因组DNA提取按照DNA提取试剂盒说明书进行。根据细菌16S rDNA 鉴定菌株的标准操作规程，将细菌16S rDNA分成3段首尾重叠片段进行扩增，片段1(引物对16S-27F /16S-519R)预计扩增片段500bp，片段2(引物对16S-357F /16S-1115R)预计扩增片段750bp，片段3(引物对16S-926F /16S-1492R)预计扩增片段560bp，引物序列信息如表1所示[5]。扩增产物送昆明硕擎生物有限公司测序，测序结果采用Vecter NTI 软件进行拼接，得到大约1500bp的16S rDNA序列。将序列提交GenBank进行Blast比对，确定细菌的种属分类。

表1 PCR 扩增引物序列信息表

2 结果

2.1 发病鸡临床症状

发病鸡精神萎靡，产蛋率降低，食欲减退，眼睛肿胀，脓液流动，鼻腔和鼻窦有浆液性分泌物，堵塞鼻孔而出现呼吸困难和甩头等现象，呼吸啰音，面部肿胀，眼结膜发红，眼睑水肿，鼻窦肿胀隆起，流鼻涕、打喷嚏(图1、2)。

图1 眼睑水肿 图2 面部肿胀

2.2 分离菌形态特征、生化试验、血凝活性试验结果

通过细菌分离及单菌落纯化，该细菌在NAD血琼脂平板上形成半透明、边缘整齐、中等大小的露珠状菌落(图3)。菌株在普通营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、血琼脂等培养基上未观察到菌落生长，因此，可判定该菌落为NAD依赖性细菌。革兰氏染色为红色短杆菌，两极染色严重，没有芽孢，表明该分离株是革兰氏阴性细菌(图4)。菌株具有红细胞凝集活性，血凝效价为4log2；分离菌葡萄糖、麦芽糖、甘露醇阳性；蔗糖、尿素阴性；分离菌符合副禽嗜血杆菌的生化培养特征，初步判断为副禽嗜血杆菌。

图3 分离菌在NAD血琼脂平板上的形态

图4 分离菌革兰氏染色结果

2.3 分离菌株PCR检测及16S rDNA扩增结果

使用16S rDNA通用引物扩增分离纯化得到细菌，并通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。扩增的DNA片段分别为500bp、750bp和560bp，扩增片段与预期的片段长度一致。阴性对照没有条带，表明扩增结果是目标结果，如图5示。PCR产物凝胶纯化后，采用产物对应的扩增引物进行双向测序。

M.分子量标准DL2000；1-3.分离菌16S rDNA片段1、2、3扩增产物。图5 分离菌16S rDNA 3个片段的PCR扩增结果

2.4 分离菌16S rDNA序列比对鉴定与分类结果

上述3个核酸片段序列通过Vector NTI 软件拼接，获得1495bp 16S rDNA核酸序列(图略)。将分离菌核酸序列提交GenBank数据库进行Blast 比对分析，结果显示分离菌株属于副禽嗜血杆菌(图6)。

图6 分离菌株16S rDNA基因片段Blast比对进行分类鉴定结果

2.5 药物敏感性试验结果

通过药敏试纸法测定分离菌对17种药物的敏感性，试验结果显示，分离株对妥布霉素、阿奇霉素、庆大霉素、阿米卡星敏感，对恩诺沙星、新霉素、环丙沙星、左氟沙星等4种药物中度敏感，对头孢氨苄、阿莫西林、四环素、青霉素G、头孢他啶、氯霉素、卡那霉素、复方新诺明、氨苄西林具有耐药性(表2)。

3 讨论

副鸡嗜血杆菌是引起鸡传染性鼻炎的病原体，可导致肉鸡生长缓慢、蛋鸡产蛋率下降，对养殖场造成重大的经济损失。据调查，2019年云南省蛋鸡和土杂鸡养殖中，鸡传染性鼻炎呈高发态势，占细菌性疫病临床病例首位，检出率为15.87%[6]。该病全年均有发生，尤以秋冬季节发病率较高，受环境等因素的影响，该病极易反复，一旦与其他疾病如大肠杆菌或支原体混感后可增加该病的严重程度，且持续时间会比较长，治愈效果较差。另外，蛋鸡产蛋期易发生本病，药物治疗造成的药残及食品安全问题不容忽视。

表2 药敏试验结果

注：S敏感；R耐药；I中度敏感。

本研究从云南蛋鸡中分离出一株依赖于NAD血琼脂生长的灰白色、圆形、边缘整齐的光滑型小菌落，而在普通琼脂、血琼脂、SS琼脂平板上未见生长，革兰氏染色为红色短杆菌，过氧化氢酶试验结果为阴性，具有红细胞凝集活性等，符合副鸡嗜血杆菌生物学特性；16S rDNA序列测定、GenBank数据库比对分析证明该分离菌为副鸡嗜血杆菌。

2019年云南省发病鸡分离鉴定的31株鸡副嗜血杆菌代表菌株药敏试验结果显示副鸡嗜血杆菌云南分离株大多为敏感型菌株[6]。本实验中分离菌株对头孢氨苄、阿莫西林、四环素、青霉素G、头孢他啶、氯霉素、卡那霉素、复方新诺明、氨苄西林等药物具有耐药性，说明该菌株存在一定的耐药性。确诊后立即使用敏感的药物对鸡群进行紧急治疗，但由于饲养环境、饲养密度等原因未能及时控制病情，仍有少量鸡群死亡。目前针对副鸡嗜血杆菌已有有效的商业疫苗，除了使用敏感药物外，针对鸡群制定有效合理的免疫程序是预防该病发生的有效方法。但是，对于多价疫苗或全价疫苗的研究和开发还任重道远。

副鸡嗜血杆菌发病率可达 20%～50%，死亡率可达 5%～20%，一旦发病，产蛋率下降10%～70%不等[7]。对于该病的防治应注意饲养环境，防寒、防湿，使鸡群有一个适度干燥、通风良好、温度适中的生活环境。尤其在气候多变季节，更应注意鸡舍环境，防止鸡舍的温度骤降，尤其是育雏栏转到育成栏时，要控制两鸡舍间的温差。同时，调整鸡群饲养密度，使鸡群有足够的活动空间；注意饲料的全价营养，可在饲料或饮水中添加维生素，增强机体抵抗力。此外，还应做好鸡舍的环境消毒，一旦发生该病应立即对养殖场进行封锁、隔离，防止疫情进一步扩散，以便更好的控制疫情。