miRNA-21-5p对食管癌的诊断价值及其与STAT3的相关性研究

王燕忠， 丁丽敏， 陈一瑞， 王永斌

（1.浙江大学医学院附属邵逸夫医院下沙院区检验科，浙江 杭州 310016；2.浙江省人民医院血液内科，浙江 杭州 310014；3.扬州大学附属医院，江苏 扬州 225001）

食管癌是一种严重影响人们生活水平的消化系统恶性肿瘤[1]。近年来食管癌在我国的发病率和致死率居高不下，我国已成为食管癌高发的国家之一。食管癌的临床症状不明显，被发现时多为晚期，因此寻找食管癌发生的生物学标志物，对于食管癌的及早发现和有效治疗具有重要的意义。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种调节内源性基因的非编码小RNA，由基因组转录生成并通过与靶基因的3'端互补配对，降解靶基因或抑制其翻译而发挥治疗作用[2]。据推测，人类1/3的基因受到miRNA调控，因此在人类生长发育和疾病的发生、发展中起着重要调节作用[3]。可调控信号传导和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）作为影响食管癌细胞增殖和凋亡的重要指标，其表达量严重影响着食管癌的发展，因此本研究探讨miRNA-21-5p与STAT3之间的靶向关系，为食管癌的治疗提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年1月—2018年6月在浙江大学医学院附属邵逸夫医院下沙院区治疗的食管癌患者78例（病例组），其中男37例、女41例，中位年龄为（46±3.9）岁。对照组是69名体检健康者，其中男33名、女36名，中位年龄为（47±4.0）岁。病例组和对照组的一般信息之间差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：（1）所有食管癌患者均首次经检查确诊，符合食管癌诊断标准，具备完整的食管癌病历资料；（2）患者入组前未进行治疗或者药物干预；（3）术后经病理诊断证实为食管癌，临床分期为Ⅰ～Ⅲ期，无转移。排除标准：（1）病历或基本资料不完整；（2）患有多种肿瘤；（3）患者间身体状况存在较大差异。本研究符合浙江大学医学院附属邵逸夫医院下沙院区伦理学相关要求，且所有患者均已签署知情同意书。

1.2 血液采集及miRNA-21-5p表达检测

采集食管癌患者、体检健康者禁食10～12 h后清晨空腹静脉血5 mL，室温放置，待充分凝固后离心，吸取血清置-80℃保存。根据血清miRNA提取分离试剂盒（日本Thermo Fisher公司）说明书要求提取血清中miRNA并测定其浓度，用Bulge-Loop TM hsa-miR RT（北京天根生化科技有限公司）代替Oligo（dT）进行逆转录，逆转录茎环状结构的引物序列为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3'。将逆转录后的产物应用扩增miRNA qRT-PCR试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）进行实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共40个循环。miRNA-21-5p的引物由广州锐博科技有限公司合成，上游引物为5'-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'。下游引物为5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；同时利用U6作为内参，U6的上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，采用2-ΔΔCt法计算miRNA-21-5p/U6的相对表达量。以上所有实验均重复3次。

1.3 预测miRNA-21-5p调控的下游靶基因

利用picTar（https：//pictar.mdc-berlin.de/）、TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）、Tarbase（http：//diana.imis.athenainnovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/index）3个miRNA数据库分别预测miRNA-21-5p调控的下游靶基因。

1.4 Draw venn diagram筛选靶基因交集

将picTar、TargetScan、Tarbase 3个数据库预测的miRNA-21-5p的下游靶基因分别导入Draw venn diagram，取出3个数据库预测的靶点交集，并且筛选出与食管癌相关靶点。

1.5 实时PCR检测食管癌患者癌组织和癌旁组织中STAT3 mRNA的表达

取食管癌根治性切除术患者癌组织和癌旁组织各1份，用液氮冷冻后在-80 ℃储存待测。根据试剂盒说明提取癌组织和癌旁组织中总RNA并测定其浓度，反转录后进行实时荧光定量PCR扩增，熔解曲线和扩增曲线见图1、图2。STAT3上游引物为5'-ATGAGTGTGGCCGTTGCA-3'，下游引物为5'-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3'，同时用3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，GAPDH上游引物为5'-GCTGAGTATGTCGTGGAGT-3'，下游引物为5'-GTTCACACCCATCACAAAC-3'。PCR扩增体系：SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，互补DNA（complementary DNA，cDNA）4 μL，H2O 5 μL，共20 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，共进行40个循环。采用2-ΔΔCt法计算STAT3/GAPDH的相对表达量。以上所有实验均重复 3 次。

图1 熔解曲线

图2 扩增曲线

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量数据以±s表示，多组之间的比较采用方差分析，2个组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-21-5p在食管癌患者血清中的表达

实时荧光定量PCR结果显示，miRNA-21-5p在食管癌患者血清中表达量（1.01±0.19）显著高于体检健康者血清中的表达量（0.23±0.07）（P=0.00）。进一步分析不同分期的食管癌患者血清中的miRNA-21-5p表达情况，发现Ⅲ期患者的表达量（1.13±0.11）显著高于Ⅰ期和Ⅱ期的患者（0.92±0.09）（P=0.01），说明miRNA-21-5p的表达量与食管癌分期有关，miRNA-21-5p表达量越高，分期越晚。这些结果说明，miRNA-21-5p高表达可以作为食管癌患者的特异性标志。

2.2 miRNA-21-5p可靶向调控STAT3

通过3个miRNA数据库分别预测miRNA-21-5p调控的下游靶基因，PicTar预测出靶基因148个、TargetScan预测出384个、Tarbase预测出742个，3个数据库取交集得到miRNA调控的靶基因有24个，其中STAT3为miRNA-21-5p调控并且与食管癌细胞的增殖和凋亡密切相关。

2.3 食管癌患者癌组织STAT3 mRNA高表达

采用实时荧光定量PCR检测食管癌患者癌组织和癌旁组织中STAT3 mRNA的表达，发现在食管癌患者癌组织中STAT3 mRNA相对表达量显著高于癌旁组织（P=0.01），并且根据Spearman相关性分析发现，其与血清中miRNA-21-5p的表达呈正相关（r=0.401，P=0.00）。见图3。

图3 STAT3、miRNA-21-5p实时荧光定量PCR检测结果

3 讨论

食管癌的发生由多因素影响且特性复杂，因此了解食管癌发生的分子机制并且找到食管癌有效的治疗途径迫在眉睫。miRNA是一种长度为21～24 nt的非编码小RNA，通过与靶基因3'非翻译区相结合而调控靶基因表达，亦可通过降解靶基因或抑制其翻译而发挥治疗作用[4]，miRNA与多种疾病相关，并且调控着疾病的不同发展阶段。有研究结果表明，在食管癌组织和正常食管组织中，miRNA的表达存在显著差异，异常表达的miRNA可以作为癌症的生物学标志，预测癌症的发生[5]。齐天伟等[6]发现，miRNA-200c显著降低可以作为食管癌发病的生物学标志，miRNA-34a可通过影响抑制食管癌细胞的增殖及凋亡达到治疗疾病的作用[7]，多种miRNA可以通过调控不同的信号分子治疗同一种疾病。SONG等[8]发现，miRNA-16过表达可抑制细胞炎症反应，并且miRNA-16可通过靶向B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因抑制细胞凋亡[9-10]，研究表明miR-16可以通过靶向调控淀粉样B（A4）前体蛋白[myloid beta（A4） presursor protein，APP]等多种基因治疗阿尔茨海默症等多种疾病[11-13]，这也说明同种miRNA可以作用于不同靶点治疗不同疾病。

本研究以食管癌患者血清为临床样本，并且与体检健康者血液进行比较，发现在食管癌患者血清中miRNA-21-5p的表达显著升高，而对照组血清样本中miRNA-21-5p相对表达量较低。因此，本研究以miRNA-21-5p为研究重点，探讨其在食管癌中的具体作用机制。通过生物信息学预测发现，miRNA-21-5p可调控多种靶基因，其中通过picTar、TargetScan、Tarbase分别预测其靶基因，发现其调控的靶基因数目分别为148、384、742个，并且我们通过Draw venn diagram取出3个数据库筛选出的共有靶基因24个，其中STAT3是与食管癌细胞增殖和凋亡密切相关的基因，STAT3的持续激活会导致食管癌细胞的快速增殖，因此本研究通过实时荧光定量PCR检测食管癌患者癌组织和癌旁组织中STAT3的表达差异，发现在食管癌患者癌组织中STAT3表达量显著高与癌旁组织，并且其表达水平与血清中miRNA-21-5p表达水平呈正相关。本研究结果显示，血清中miRNA-21-5p的异常升高可以作为食管癌发生的生物学标志，其作用机制可能与上调患者癌组织中STAT3表达促进食管癌细胞增殖有关。