黑蜂蜂毒的提取及抗肿瘤研究

王林，关楠楠，李婷婷，王丽丽，李春丰,2*，罗志文,2*

(1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯154007;2.佳木斯大学应用昆虫研究所，黑龙江佳木斯154007)

东北黑蜂是我国具有独特生物特性的地方纯系优良蜂种，与某些西方蜂种存在很强的配合力，其杂交种类可在我国北部地区进行大规模饲养，是良好的蜂种资源，主要产区地处黑龙江省双鸭山市饶河县东北黑蜂国家级自然保护区内[1]。体型较大周身近黑色，繁殖力较强，有极强的抗病和抗逆性[2]。其产物如蜂蜜、蜂王浆给人类带来巨大的经济价值，其毒腺也是一个重要的药物宝库。

蜂毒是由工蜂尾部螫刺腺体中排出的毒汁，蛰刺时经由螯针排出。成分复杂，药用价值极高[3-4]。蜂毒作为一种具有生物活性的天然的生物毒素，内含多种生理活性物质，例如蜂毒肽、蜂毒明肽、托肽品、肥大细胞脱粒肽(MCD 肽)、镇静肽、安度拉平、心脏肽、透明质酸酶、磷脂酶A2、组织胺等。主要具有抗炎、降压、镇痛、抗菌、抗辐射、抗肿瘤和抗病毒等作用。笔者通过实验对粗蜂毒进行提纯并利用蜂毒提取物作用于H22小鼠，研究抗肿瘤效果。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物。昆明小鼠，体重20±2 g。正常进食、喂水,每日光照。适应新环境后经由仔细观察挑选，将健康的小鼠取出进行分组。肿瘤细胞株。H22细胞，由佳木斯大学实验动物中心提供。实验仪器：可见分光光度计；离心机；电子天平；微量注射器；手术剪刀；镊子；游标卡尺。实验药品：黑蜂蜂毒(购自饶河县黑蜂蜜蜂园)；丙酮；肝素；台盼蓝染液；环磷酰胺(CTX)。

1.2 方法

黑蜂蜂毒的提取：取蜂毒1 g加蒸馏水20 mL后振荡，使其充分消融。将100 mL丙酮装入事先准备好的小广口瓶中，放入冰箱冷冻室(-18 ℃)内约1 h进行预冷。预冷完毕后取出,向试管内注入20 mL，再将已溶解的蜂毒溶液注入试管内并用玻棒不断搅拌，混合液体显灰白色。随后将混合液分装两个离心管内，再用WS低速离心机以3000 r/min 的速度离心15 min。离心完毕取出离心管，将上层液体倒掉，离心管底部留有一些浅棕色的沉淀物质[5]。再向离心管内内加入丙酮20 mL，用玻棒将沉淀物捣碎，仍以3000 r/min 继续离心15 min，再次倒掉上清液。将管底沉淀物取出，用吹风机快速吹干后再用玻棒将沉淀捣碎，装入小棕色瓶中备用。

荷瘤小鼠的制备：将接种H22细胞株的小鼠脱颈处死，放入75%乙醇中处理3 min,在无菌条件下剪开小鼠腹部皮肤，用镊子夹起腹膜用手术剪刀开一小口，无菌吸管抽取含H22细胞的腹水转移至烧杯中。用无菌生理盐水加肝素溶液将腹水稀释后，用低速离心机800 r/min离心5 min，去除上清液得到瘤细胞，再加入生理盐水调整肿瘤细胞浓度，在显微镜下通过滴用0.4%台盼蓝染色计数(>95%)，通过 PBS 将细胞数调至约为 1.0×10 /mL[6]。(每mL稀释液中含1.0×10 个细胞) 混匀细胞后,在昆明小鼠右前肢腋下靠外侧皮下注射0.2 mL H22细胞悬液，创建H22移植瘤小鼠模型。小鼠造模24 h后进行随机分组，分组完毕即可注射蜂毒。鼠笼内定期清理垫料，尽量保证干净的生活环境，大约1周后肿瘤体积可达到 100 mm ，重量1 g左右时可用于抑瘤实验。

蜂毒抗肿瘤实验：待荷瘤小鼠肿瘤体积到达约100 mm 时，筛选瘤径大小相似的小鼠20只，随机均分为5组：生理盐水阴性对照组、CTX阳性对照组、蜂毒肽高剂量、中剂量和低剂量实验组[7]。各组均为腹腔注射，各组注射量相等，每天注射1次，持续10天。每天在固定时刻点称量一次小鼠体重，并用游标卡尺量取肿瘤体积，肿瘤体积计算公式：V(体积)= L(长)× W (宽)/2。经过10天的给药、观察和测量后，处死5组小鼠，剥离出瘤块组织称重，用于评价蜂毒对肿瘤的抑制效果，计算抑瘤率。

抑瘤率=(阴性对照组肿瘤的均重-蜂毒组肿瘤的均重)/阴性对照组肿瘤的均重×100%[8]。

2 结果与分析

2.1 丙酮提取效果

表1 粗蜂毒与提纯后蜂毒比较结果

实验结果显示，粗蜂毒经处置后，pH从4.7升高到5.6，颜色变浅，得率约为81%。

2.2 黑蜂蜂毒抑瘤效果

表2 黑蜂蜂毒对H22小鼠肿瘤生长的影响

注：与阴性对照组比较：p<0.05

表2结果表明，蜂毒低中高3个浓度组瘤重都显著小于阴性对照组；高剂量组抑瘤率大于低、中剂量组，从表中还可看出蜂胶的抑瘤性与剂量成正比，高剂量组效果最佳，并且有显著性差异(p<0.05 )，表明东北黑蜂蜂毒能抑制肿瘤的生长。

3 结论与讨论

粗蜂毒电泳色带分界不明显，样品中应该含有糖类物质。而经过丙酮和凝胶层析处置后，能出现2条清楚的电泳色带，则说明丙酮能将稠浊的蜂蜜成份清除干净，凝胶层析可进一步纯化蜂毒成分。颜色变浅，pH从4.7 上升到5. 5则说明清除了大部分杂质和一些有机酸成分。另外得率可达81%, 说明提纯过程中损失较小，达到了预期目的。

蜂毒抗肿瘤的机制主要有直接杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡以及调节细胞周期。通过用东北黑蜂毒素对H22小鼠肿瘤进行实验，发现东北黑蜂蜂毒能抑制肿瘤的生长，H22小鼠的生命延长，证明了蜂毒具有直接杀伤小鼠肿瘤细胞的作用，直接杀伤肿瘤细胞同时对肿瘤也有一定的治疗作用。