美味牛肝菌液体菌种摇床发酵条件的研究

宋佩东

(辽宁省高速公路营运管理有限公司本溪分公司，辽宁本溪117000)

我国杨树资源丰富，如何合理开发利用林下经济资源是现在林业发展新的研究方向。食用菌作为人类食用的第二大蔬菜，更适合这种弱光，高湿及土质丰富的林下环境，同时它也是食品工业和医疗保健工业重要的原料。现在很多菌种人工栽培规模很大，筛选适合杨树林地半野生栽培的菌种，要着重从它的药用价值入手。美味牛肝菌(Boletusedulis)属于担子菌亚门(Basidiom ycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricases)、牛肝菌科(Boletaceae)[1]。它是一种食药兼用经济价值较高的真菌，全国各地均有分布[2]。它含有丰富的蛋白质和脂肪，含有人体必需的多种氨基酸、维生素及微量元素，有防病治病、强身健体的功能，因此国内外市场的需求量不断增加[3]。发酵菌丝体培养周期短、生长快，易于大规模工业生产，从其发酵液或固体培养物得到的菌丝体作为保健食品或提取多糖具有很好的应用前景[4-5]。本文主要对牛肝菌的液体发酵培养条件进行了优化研究，期待为美味牛肝菌杨树林下栽培提供一定的前期理论基础。

1 材料

1.1 菌株

美味牛肝菌，购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 基本发酵培养基

葡萄糖5 g，麦芽糖22 g，酵母膏14 g，硫酸铵2.7 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸亚铁67 mg，硫酸铜100 μg，加蒸馏水1000 mL。

1.3 仪器设备

LGJ-10型冷冻干燥仪；A2级生物安全柜；AL104型电子天平；HH·S21-6-S恒温水浴锅；KDM型调温电热套；MLS-3020型全自动高压蒸汽灭菌器；DHG-9240(A)鼓风干燥箱；HZQ-C型恒温振荡器。

2 方法

2.1 液体发酵培养[6-8]

选出菌株生长均匀的一个平面培养的平皿，用无菌打孔器(直径10 mm)打孔，无菌镊子夹取一片菌丝碟接种于盛有100 mL发酵培养基的三角瓶中，28 ℃，160 r/min摇床发酵培养。分别测定每天菌丝干重，方法是用漏斗过滤发酵液，保留的菌丝于40 ℃的烘箱中烘干称重，即为菌丝的干重。以发酵时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标作生长曲线。

2.2 美味牛肝菌液体发酵条件的优化

2.2.1 单因素分析[9-11]。一般影响菌丝液体发酵培养的条件因素有培养温度、摇床转数、装液量和初始pH等。本试验选择了影响显著的4个因素，每个因素多个梯度值进行单因素分析。

培养温度：选择24、26、28、30、32 ℃五个梯度对菌丝体进行培养。

摇床转数：选择110、130、150、170、190 r/min五个梯度对菌丝体进行培养。

初始pH：选择3.7、3.9、4.1、4.3、4.5、4.7七个梯度的起始pH。

装液量：选择50、100、150、200、250 mL五个梯度的装液量。

每个实验3次重复，进行液体发酵培养至菌丝生长量最多的时期，测其发酵液中美味牛肝菌菌丝干重。

2.2.2 正交试验分析[12-14]。确定发酵条件中每个因素对美味牛肝菌菌丝干重影响较大的3个水平，进行L9(34)正交试验。各试验因素和水平见表1。

表1 发酵正交试验因素和水平表

3 结果与分析

3.1 美味牛肝菌生长曲线[15]

图1 美味牛肝菌生长曲线

从图1中可以看出，该菌种2 d开始进入对数生长期，5 d达到最高峰，之后进入稳定期，持续1 d后进入衰老期，因此5 d是美味牛肝菌菌株最佳的培养时间。

3.2 美味牛肝菌发酵条件优化[16-17]

3.2.1 培养温度对美味牛肝菌生长的影响

图2 培养温度对美味牛肝菌生长的影响

如图2， 28 ℃菌丝质量最高达到1.962 g。显然较低的温度不利于菌丝的生长，但温度过高，自身物质消耗过快，生物量降低。因此选择28 ℃作为最适的培养温度。

3.2.2 不同转数对美味牛肝菌生长的影响

图3 摇床转数对美味牛肝菌生长的影响

如图3，摇床转数过高或过低均不利于菌丝生长，当转数为150 r/min，菌丝质量最高达到2.173 g，其余转数下的菌丝质量均较低。因此确定最佳转速为150r/min。

3.2.3 初始pH对美味牛肝菌生长的影响

图4 初始pH对美味牛肝菌生长的影响

如图4，美味牛肝菌的液体培养对pH的适应范围较广，起始pH在3.7～4.3范围内菌丝生长随着pH的增大而增快，pH4.3时菌丝干重最高1.942 g，但pH高于4.3时菌丝生长随之下降。因此选择最适pH为4.3。

3.2.4 装液量对美味牛肝菌生长的影响

图5 装液量对美味牛肝菌生长的影响

如图5，开始菌丝生长随着装液量的增加而增多，当装液量为150 mL菌丝含量达到最高，为2.202 g，随后逐渐降低。因此以150 mL的装液量最为适宜。

3.2.5发酵条件的正交试验分析

表2 发酵正交试验结果的极差分析

如表2，各因素对美味牛肝菌生长影响程度依次为B>A>C>D，ABCD四因素理论最佳组合为A2B3C1D1，即培养温度28 ℃、摇床转数170 r/min、初始pH4.1、装液量100 mL。其中摇床转数对美味牛肝菌生长影响显著。

4 结论与讨论

通过单因素和正交试验结果分析，美味牛肝菌最适发酵条件为：培养温度28 ℃、摇床转数170 r/min、pH4.1、装液量100 mL。通过验证试验在此条件下的菌丝干重为2.215 g。

发酵条件中各因素都会影响菌丝的生长，温度是影响微生物生长的重要因素，适宜的生长温度能最大限度的发挥细胞内代谢途径中酶的活力，使细胞生长旺盛；搅拌作用直接影响发酵基质的传递和溶氧水平，最终与发酵产物的产率和质量息息相关；pH对细胞发育产生直接的影响，还对细胞产生不同程度的间接影响，它影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响环境中有害物质对微生物的毒性；在好氧菌的深层培养中，氧气的供应是发酵能否成功的重要限制因素之一。装液量过大时，培养基中溶解氧较少，不利于菌丝生长，装液量小时，摇瓶中很难形成旋涡，不利于菌球的形成。

本研究获得了美味牛肝菌液体发酵最佳发酵条件，为美味牛肝菌杨树林下栽培提供前期的试验基础。美味牛肝菌是林下经济作物食用菌优良品种的选择之一。期待为美味牛肝菌的经济价值及其药用价值的开发提供一定的理论基础。