金属离子显色法对不同种属天然药物的抗氧化活性研究*

郭新颖，陈 峰，杨清华，戴志英，杨梅桂，顾 俊

（江苏省南通市疾病预防控制中心 理化科，江苏 南通 226007）

人体由于抗氧化失衡引发各种疾病的不良物质之一是自由基，它可使细胞膜受损、蛋白质变性、酶失去活性、脂质过氧化等。而羟自由基（·OH）又是所有活性氧自由基中生物活性最为活跃、危害最大的一类。因此，如何有效消减清除体内多余·OH以减缓人体衰老、增强人体免疫力，成为人类对抗疾病和死亡的永恒课题。天然药物是动物、植物和矿物等自然界中普遍存在的有药理活性的天然产物，其本身具有药效，且毒副作用比人工合成的化学药品低得多，被称为天然“药片”。天然药物因其高效安全、毒副作用小等优点，已在医疗保健、养生防病等方面广泛应用，用以研制抗病保健等抗氧化作用的天然药物前景看好，一些具预防与保健功能的天然药物逐渐受到青睐，成为防治各种因抗氧化失衡引起的癌症、艾滋病、心脑血管病、糖尿病等疾病的研发热点。中国拥有天然药物宝库，具有药食两用中药的重要资源原料。如橘子、山楂、南瓜、甘蓝、茉莉花和金银花等，它们有些既属于中药，又是常吃的富有营养的食品饮品，同属天然药物，亦具有良好的治病疗效。目前已知的天然药物中含有的主要抗氧化成分如橘子中的多酚类和橙皮苷[1]，山楂中的黄酮类和原花青素B2[2]，南瓜中的总酚和儿茶素类[3]，甘蓝中的多酚和花色苷[4]，茉莉花中的黄酮类和多糖[5]，以及金银花中的多酚和黄酮类[6]等等的成分筛选和检测研究，已经被越来越多的学者关注和研究。本试验是在新型·OH反应体系的基础上对以上6种天然药物进行抗氧化活性分析，研究结果可为药食同源的天然药物、保健食品药品和绿色食品等黄金健康产业开发提供重要理论基础。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

罗丹明 B、MnSO4、H2O2、H2SO4，购自国药集团化学试剂有限公司，均为国产分析纯；天然药物均为市购。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器设备

UNICO7200型分光光度计（上海分析仪器厂）；FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；XQ100粉碎机（四方仪器有限公司）；KQ-300TDB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 样品提取

选取水果、蔬菜、花类等6种天然药物，洗净、晾干、粉碎过筛。准确称取5.0g，加入50mL水，浸泡、超声、过滤、离心，取上层清液，在4℃条件下贮存待测。

1.4 检测方法

在比色管中按顺序分别加入浓度为5.0×10-2mol·L-1的 RB 溶液 0.4mL，1.0×10-2mol·L-1的H2SO4溶 液 0.5mL，5.0×10-4mol·L-1MnSO4溶 液0.80mL和0.1%H2O2溶液1.0mL，定容至10mL，放置7min待测。同样的，在比色管中仅加入0.4mL 5.0×10-2mol·L-1的 RB 溶液和 0.5mL 1.0×10-2mol·L-1的H2SO4溶液作为试剂空白。将加入或者未加抗氧化剂的反应体系分别在550nm处测定吸光度值，分别记作AS和A，计算反应体系吸光度值AS或者A值与空白参比吸光度A0值的差值，通过测定·OH反应前后溶液的吸光度变化差值△A值间接测定抗氧化剂的·OH清除率。反应体系清除率CR%的计算公式[7]：

2 结果与讨论

2.1 吸收曲线

在7200型分光光度计上于510～590nm的波长范围内分别测定空白体系和RB-Mn2+-H2O2反应体系溶液的吸光度值，对比溶液吸收光谱曲线可知，·OH体系可氧化RB使化学试剂产生褪色效应。由于RB在550nm处吸光度值为最大，故本试验选择550nm为溶液测定波长。

2.2 试验影响因素分析

由于类Fenton试剂反应体系同Fenton反应一样在酸性条件下会产生·OH，而·OH又是链接反应的有效因子，因此，类Fenton试剂的配比如反应物Mn2+、H2O2和OH-的浓度，溶液pH值以及反应时间共同决定了·OH的产量和反应程度。本试验分别对反应体系中的酸用量、RB用量、Mn2+用量、H2O2用量和反应时间进行试验，用于探索RB-Mn2+-H2O2检测体系的最佳实验条件。

2.2.1 酸度的影响 在类Fenton试剂反应体系中，·OH的产生与酸度有关，本试验在酸性溶液中进行试验，选择H2SO4为溶剂介质，当加入0.5mL 1.0×10-2mol·L-1的H2SO4溶液时，体系较稳定、化学试剂反应较明显、褪色效果较好。

2.2.2 显色剂的影响 化学显色剂RB用量的增加会使△A值增大，但用量过大会导致空白参比吸光度超出正常读数范围，本试验选用浓度为5.0×10-2mol·L-1的 RB 溶液 0.4mL。

2.2.3 锰基离子的影响 在RB-Mn2+-H2O2检测反应体系中，当Mn2+浓度很低时，反应速度慢、反应受限；当Mn2+浓度过高时，△A值增加影响读数，综合考虑，本试验选择 5.0×10-4mol·L-1的 MnSO4溶液0.80mL。

2.2.4 H2O2的影响 为提高H2O2利用率和氧化效果，试验使用0.1%的H2O2溶液。当体积用量为1.0mL时，△A值较好。

2.2.5 时间的影响 本法的稳定性较好，经测试，体系在7～10min内△A值基本无变化，试验时将反应时间调整为7min。

2.3 天然药物提取物的抗氧化作用

本试验以·OH的清除能力作为评价天然药物体外抗氧化活性的检测指标，试验中对不同种属的水果中的橘子和山楂、蔬菜中的南瓜和甘蓝、花蕾中的茉莉花和金银花等天然药物提取物的·OH清除能力（以清除率计）进行了测定，结果见表1。

由表1结果发现，这6种天然药物提取物均存在较强的抗氧化能力，但清除能力大小有差别。其中橘子、山楂和金银花的·OH清除能力显著高于南瓜、甘蓝和茉莉花的清除能力，各种天然药物的清除率分别为：橘子56.13%，山楂55.42%，金银花56.97%，南瓜29.84%，甘蓝37.45%，茉莉花27.58%。这6种天然药物抗氧化能力的大小或可由其中含有的多酚类、黄酮类等已知的主要抗氧化成分所决定。

表1 天然药物提取物对·OH清除率（n=7）Tab.1 Scavenging rate of natural medicine extracts（n=7）

3 结论

本文建立了一种新型金属离子联合化学试剂显色光度法作为天然药物体外抗氧化羟基自由基活性的快速筛选与定量检测方法，试验以·OH的清除能力为体外抗氧化指标，研究了6种天然药物提取物的体外抗氧化活性，比较了其体外抗氧化能力的大小。同时，试验还探究了溶剂介质浓度、反应物浓度和检测时间等因素对抗氧化物质水提物的影响。本试验的研究结果表明，6种不同种属的天然药物提取物具有较强的体外抗氧化活性，可有望将其开发为功能性食品药品或新型复合抗氧化剂等，也为开发利用水果蔬菜花蕾的多酚黄酮等天然药物资源成分提供理论科学依据。当然，由于本试验采用的原料、方法、仪器不同导致测定结果有所差异，抑或与样品中多酚黄酮类成分的含量相关。有关天然产物的抗氧化性及其作用机制还有待于进一步的研究。