hsa-miR-216a-5p的靶基因及调控网络的生物信息学分析

马 亮，张运峰，董建悦，胡 芬

生命科学与技术

hsa-miR-216a-5p的靶基因及调控网络的生物信息学分析

马 亮1，张运峰2，董建悦2，胡 芬1

（1. 华北理工大学 生命科学学院，河北 唐山 063210；2. 唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

利用miRBase、生物信息工具bioinfo和TargetScan7.2、miRDB、miRDIP和miTarBase四个数据库获取了八个物种的miR-216a-5p成熟序列、表达谱数据和129个靶基因。对靶基因集合进行GO、KEGG分析，结果显示hsa-miR-216a-5p主要富集在转录DNA模板、转录生长因子beta受体信号通路、蛋白稳定化等10个生物过程（P<0.01），泛素蛋白连接酶活性、SMAD蛋白结合、蛋白泛素化等4个分子功能（P<0.01）以及糖尿病、内吞作用、TRF通道的炎性介质调节等5个KEGG通路中（P<0.05）。借助构建PPI蛋白互作网络，从129个靶基因中筛选出了PTEN、SIRT1、TGFBR2等10个关键基因。

hsa-miR-216a-5p；靶基因；生物信息

miRNA（microRNA）是一类广泛存在于动植物和某些病毒体内长度为22nt左右的单链非编码RNA分子，通过结合靶mRNA的3’UTR区阻止其翻译或促进其降解而发挥功能[1]。miRNA具有高度的序列保守性，从而能够广泛调节多种生命活动。miR-216a-5p在多种癌症的发生发展中具有调控作用。在肝细胞癌（HCC）的发生过程中，mR-216a-5p可通过JAK2靶向抑制癌细胞的增殖和侵袭[2]，通过下调MMP16抑制肺癌细胞的侵袭[3]，也能以PAK2为靶基因实现对膀胱癌细胞增殖和凋亡的调控[4]，另外还可抑制HMGB1的表达从而抑制胃癌细胞的增殖和迁移[5]。

到目前为止，hsa-miR-216a-5p众多靶基因尚不十分清楚。本研究拟采用生物信息学的方法利用公共数据库对hsa-miR-216a-5p进行靶基因预测，并采用DAVID网站对获得靶基因集合进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，利用STRING数据库和Cystocape 3.7.1软件构建蛋白互作网络并筛选出关键基因，为进一步深入分析hsa-miR-216a-5p的功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 miR-216a-5p序列信息获取

通过在线公共数据库miRBase（http://www. mirbase.org）下载人、猕猴等八个物种的miR-216a-5p的成熟序列，利用MEGA-X软件分析其序列保守性。

1.2 hsa-miR-216a-5p表达谱分析

采用癌症基因组图谱计划（TCGA）数据库信息，利用生物信息学在线分析工具（http:// bioinfo.life.hust.edu.cn/miR_path/index）获得hsa-miR-216a-5p在人类各个癌组织和癌旁组织的表达谱。

1.3 靶基因预测

分别采用数据库TargetScan7.2、miRDB、miRDIP进行hsa-miR-216a-5p的靶基因预测，使用venny2.1进行韦恩图绘制。利用miTarBase数据库获取经过实验验证的靶基因，综合四个数据库整合靶基因集合，用于后续分析。

1.4 GO和KEGG分析

利用在线网站DAVID（https://david.ncifcrf. gov）对得到的hsa-miR-216a-5p靶基因集合，分别进行生物过程、细胞组分、分子功能GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 靶基因PPI网络构建及关键基因筛选

将上述获得的靶基因集合输入STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）数据库，构建PPI蛋白互作网络，并结合Cystocape 3.7.1软件进行数据可视化，通过使用CytoHubba插件进行关键基因的筛选。

2 结果

2.1 hsa-miR-216a-5p基因序列保守性分析

如图1，在人、猕猴、小鼠、大鼠、安大略鲑中miR-216a-5p的成熟序列为22个碱基，在兔、犰狳、豚鼠中为23个碱基，八个物种miR- 216a-5p成熟序列基本一致。

图1 miR-216a-5p 在8个物种中成熟microRNA序列比对结果

2.2 hsa-miR-216a-5p表达谱分析

如图2，相较于正常组织，在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、宫颈癌（CESC）、食管癌（ESCA）等中呈现高表达，miR-216a-5p在这些癌症中可能充当癌基因。另外在肾嫌色细胞癌（KICH）、肾乳头状细胞癌（KIRP）中呈现低表达，推测其可能作为抑癌基因存在。

图2 TCGA分析hsa-miR-216a-5p的表达谱。

2.3 hsa-miR-216a-5p靶基因预测

采用数据库TargetScan、miRDB、miRDIP预测hsa-miR-216a-5p的靶基因，分别获得372个、577个、845个靶基因，对数据取交集共获得122个靶基因，详见图3a。结合miTarBase数据库经过双荧光素酶报告实验、western blot和qPCR验证的靶基因10个（PTEN, SIRT1, CDC42, CD44, SMAD7, BECN1, HNF4A, JAK2, CEMIP, CBL），共获得129个靶基因，详见图3b。

2.4 hsa-miR-216a-5p靶基因的GO功能注释和KEGG通路富集

采用DAVID对hsa-miR-216a-5p靶基因进行GO分析，结果表明靶基因主要富集在转录DNA模板、转录和转化生长因子beta受体信号通路、表皮生长因子激活受体的隐性调节等10个生物过程（P<0.01），泛素蛋白连接酶活性、SMAD蛋白结合、蛋白泛素化和蛋白结合4个分子功能（P<0.01），详见图4。

图4 hsa-miR-216a-5p靶基因GO功能显著性富集分析结果

使用在线网站DAVID进行了靶基因KEGG通路富集分析，结果发现共有47个靶基因富集到KEGG通路上，其中主要富集在年轻的成年发病型糖尿病、内吞作用、TRF通道的炎性介质调节、细胞黏着和癌症microRNA等5个通路（P<0.05）。结果见表1。

表1 hsa-miR-216a-5p靶基因KEGG通路富集分析结果

2.5 构建靶基因PPI网络并筛选关键基因

通过上述实验获得的hsa-miR-216a-5p靶基因集结合STRING数据库构建其蛋白互作网络图（PPI），得到一个有76个node，123个edge的蛋白互作网络图。下载节点数据文件导入Cytoscape 3.7.1，使其数据可视化，利用CytoHubba插件计算PPI中各个基因的节点度（degree），筛选核心蛋白质的编码基因。进而得到10个关键基因：PTEN、SIRT1、TGFBR2、CDC42、XIAP、CD44、SMAD7、CBL、ZEB1和HNF4A，详见图5。

图5 has-miR-216a-5p关键靶基因筛选

3 讨论

miRNA与众多生理过程有密切关系，如分化、增殖、凋亡与发育等[6]。目前，miR-216a-5p的研究主要集中于癌症的发生发展中。CHEN等[7]研究发现，在肾细胞癌中miR-216a-5p显著上调表达，并促进癌细胞增殖抑制其凋亡，可作为肾细胞癌的标志物，但尚未给出其靶向调控基因。然而在肺细胞癌中miR-216a-5p却通过靶向调控Bcl-2、Bax、Bad蛋白（family proteins），从而抑制细胞增殖和转移并影响细胞周期活动[8]；Zhang Y等人[9]研究证实，在乳腺癌的发生发展中，miR-216a-5p通过靶向调控PAK2蛋白的表达进而抑制癌细胞增殖和转移。通过这些研究可知，miR-216a-5p是调控癌症细胞增殖、转移和凋亡的关键因子，由此可推测，其可作为癌症早期诊断的生物标志物。

miRNA作为一种小型单链RNA分子越来越多地受到关注。研究表明，其主要通过和靶mRNA的3’UTR区结合抑制其翻译或促进其降解而发挥功能，所以往往伴随着众多靶基因的异常表达。如何快速准确地预测其靶基因显得尤为重要。生物信息学方法预测mRNA靶基因的工具很多，目前为止使用较多的有TargetScan7.2、miRDB、miRDIP这三种[10,11]。其中miRDB为第一代预测软件，其不受物种限制，支持在线和本地，支持各种平台，产出多但精度低。TargetScan7.2为第二代预测软件，预测精度大为提高，假阳性较低；miRDIP为最新预测软件，搜索功能强大，整合了多达30个数据库的资源但精度低。这三者所使用的算法各有优势，能互为补充，还可降低假阳性率和扩大搜索范围。本研究整合经过实验验证数据库miTarBase结果，共获得了129个靶基，为进一步实验工作指明了方向。

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[3] 崔艳丽,李小亮,何利珍.miR-216a-5p通过抑制HMGB1降低胃癌细胞系MGC-803的增殖和迁移[J].基础医学与临床,2019,39(4):546-551.

[4] 邵焕军,赵振伶,郝丽娜,等. miR-216a-5p靶向作用于PAK2对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响的体外研究[J].医学研究杂志,2018,47(6):151-155.

[5] 安宁,李宏敏,于瑞莲,等.miR-216a-5p通过下调MMP16表达抑制肺癌细胞的侵袭[J].中国癌症杂志,2015, 25(8):588-594.

[6] He L, Hannon G J. MicroRNAs: Small RNAs with abig role in gene regulation[J]. Nature Reviews Genetics, 2004, 5(7): 522- 531.

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Bioinformatics Analysis of Target Gene and Regulatory Network of hsa-miR-216a-5p

MA Liang1, ZHANG Yun-feng2, DONG Jian-yue2, HU Fen1

(1. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China; 2. Department of Life Science, Tangshan Normal University, Tangshan063000, China)

The mature sequences of miR-216a-5p were obtained by miRBase, and its conservation was analyzed by MEGA-X. The expression profile of has-miR-216a-5p was get from bio info web. A total of 129 target genes were obtained integrating four database target genes of TargetScan7.2、miRDB、miRDIP and miTarBase. The GO function annotation, KEGG pathway analysis and PPI were performed on the target genes. The results show that they are mainly enriched in 10 biological processes such as transcription and DNA-templated (p<0.01), 4 molecular functions such as ubiquitin protein ligase activity (p<0.01), and 5 KEGG pathways such as maturity onset diabetes of the young (p<0.05). Ten key genes such as PTEN, SIRT1, TGFBR2 were screened out from 129 target genes by constructing PPI protein interaction network.

hsa-miR-216a-5p; target genes; bioinformatics

Q279

A

1009-9115(2020)03-0067-04

10.3969/j.issn.1009-9115.2020.03.016

河北省自然科学基金项目（H2018209140，C2019105055）

2019-12-16

2020-04-06

马亮（1994-），男，河北邯郸人，硕士研究生，研究方向为肿瘤遗传学。

胡芬（1983-），女，河北唐山人，博士，副教授，研究方向为生物化学与分子生物学。

（责任编辑、校对：李春香）