外泌体对老龄小鼠骨髓间充质干细胞衰老影响的初步研究

吴晓恋， 傅稼耀， 武文婧， 谢培进， 吴珺华

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院·同济大学附属口腔医院口腔修复教研室，上海200072）

口腔颌面部外伤、肿瘤或拔牙后牙槽骨吸收等都会造成颌骨骨缺损，目前主要通过自体或异体骨移植、骨引导再生技术等进一步修复，但仍有一定的局限性。 骨髓间充质干细胞 （bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs） 因其具有多向分化潜能，可促进骨缺损修复[1-2]，是组织工程技术中的关键；但因BMSCs 自身存在衰老问题[3]，有研究证明老龄化机体的BMSCs 成骨分化能力大大降低[4]，可能是老龄化患者骨再生修复缓慢的原因之一。

外泌体（exosome）作为一种细胞间信息传递的生物活性物质， 近年来成为科学研究的前沿和热点，BMSCs 是分泌外泌体能力最强的细胞之一。BMSCs 来源的外泌体（BMSCs-exo）具有与BMSCs 相似的多种生物学功能，其内含有近50 种miRNAs，已被证实广泛参与了细胞生物学中多种生理机制的调控[5]。 BMSCs 来源的外泌体具有与BMSCs 相似的多种生物学功能，如减轻心肌缺血和再灌注损伤[6]，减轻肾脏损伤[7]，参与免疫系统功能调节[8]，调节肿瘤的发生、发展[9]，治疗神经系统性疾病[10]，改善骨质疏松症[11]，促进软骨修复[12]等。 而且BMSCs 分泌的外泌体不仅能作用于周围的细胞进行组织修复， 还能特异性地识别BMSCs，起到自我调节作用。

衰老细胞不仅自身功能减退，有研究发现衰老的细胞还会分泌大量的生物因子， 在其周围形成衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）， 诱导周围组织出现连锁反馈[13]；但关于外泌体在BMSCs 衰老过程中的作用， 鲜见报道。 本文拟对年轻小鼠来源外泌体对老龄小鼠BMSCs 衰老的作用及机制进行初步探索，为老龄患者颌骨缺损修复时外泌体的临床应用提供基础研究依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6 小鼠由上海斯莱克动物实验有限公司提供，饲养于同济大学动物实验中心。

1.1.2 实验试剂 无外泌体血清（EXOFBS50A-1，BI 公司， 美国）， 外泌体提取试剂盒（4478359，Life公司， 美国），PKH67 荧光染色剂 （Sigma 公司，美国），总RNA 提取试剂盒（Invitrogen 公司，美国），衰老细胞β-半乳糖苷酶染色试剂盒（碧云天公司，中国）。 细胞转染试剂盒，miR-199a-3p mimics，miR-214-3p mimics，miR mimics 阴性对照 （广州锐博生物科技有限公司，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠BMSCs来源外泌体的分离、提纯及鉴定 将3～4 周龄的小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡10 min；无菌条件下取出股骨及胫骨，去净软组织，剪去长骨两端，暴露骨髓腔，用1 mL 注射器吸取含10%胎牛血清、1×双抗的α-MEM 培养基冲洗骨髓腔，接种于培养皿内，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养； 培养3 d 后换液， 磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗2 遍后，加入8～10 mL 完全培养液培养；当细胞融合度达80%时传代，培养至P3 代， 待细胞融合至70%左右时， 将培养基换成10%无外泌体血清+1×双抗+α-MEM 培养基； 培养3 d 后收集细胞培养基，于4 ℃下400×g 离心15 min，进行2 次以去除培养基中的细胞碎片；于4 ℃下5 000×g 离心15 min，进行2 次以去除培养基中的凋亡小体等，弃沉淀物，收集上清液；在上清液中加入1/2 体积的外泌体提取试剂，上下颠倒充分混匀，置于4 ℃静置，孵育12～16 h；将混合液分装，于4 ℃下10 000×g 离心120 min，弃上清液，沉淀部分即为分离的外泌体。 经透射电镜扫描、粒径检测及流式细胞仪表面标记物检测，进一步鉴定分离、提纯的物质。

1.2.2 PKH67 荧光标记外泌体 将PKH67 原液按1∶500 比例稀释，取500 μL 稀释后的PKH67 染料，加入至用试剂盒提取获得的外泌体中，加样器轻柔混匀，25 ℃下孵育2～5 min，以加入同样染料的PBS作为对照组。 孵育后加入等体积的1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液1 min，作为终止液，终止染色反应。将PBS 加入超滤管内至30 mL，用试剂盒提取外泌体，重复1 次，对照组做相同处理，离心后用PBS 重悬，备用。 将PKH67 染色后的外泌体按照1 μg/mL 的浓度加入衰老小鼠BMSCs 中作为实验组（BMSCs+外泌体），将PKH67 染色后的等体积PBS 加入衰老小鼠BMSCs 中作为对照组（BMSCs+PBS），培养箱中分别培养3、6、12 h。PBS 冲洗2 次，加入4%多聚甲醛固定30 min。 PBS 冲洗2 次后，用DAPI 荧光染料将细胞核染色。 用抗荧光淬灭剂封片，避光保存。 通过荧光显微镜获得图像。

1.2.3 年轻小鼠BMSCs来源外泌体作用于老龄小鼠BMSCs衰老情况的检测 提取老龄小鼠BMSCs培养至P3 代，制备为细胞悬液，计数后以1×108个/mL 的密度接种在60 mm 培养皿中； 将提取的年轻小鼠BMSCs 来源的外泌体按10 μg/mL 的浓度加入10%无外泌体血清和1×双抗及α-MEM 配制成的完全培养基中，使用等量PBS 加入10%无外泌体血清和1×双抗及α-MEM 配制成的完全培养基作为阴性对照。 细胞接种次日，去除原培养液，PBS 洗2 遍，将以上2 组培养基加入培养皿中， 放进培养箱培养3 d， 分别进行CCK-8 检测、 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测及β-半乳糖苷酶染色分析。

1.2.4 年轻小鼠和老龄小鼠BMSCs来源的外泌体基因芯片检测 分别提取年轻小鼠及老龄小鼠BMSCs 来源的外泌体， 加入等体积TRIzol 裂解液裂解30 min，然后加入1/5 体积的三氯甲烷，上下剧烈颠倒混匀，静置1 min；于4 ℃下12 000×g 离心15 min，转移上层的无色水相层液体至新的离心管中，加入等体积无水乙醇（勿触碰沉淀物），轻轻上下颠倒混匀，移至RNA 取管中；于4 ℃下12 000 × g离心15 min，按照说明书，依次加入试剂盒中的缓冲液，加15 μL 的RNase-free 水，溶解RNA。 RNA浓度及纯度测定:取1 μL 总RNA 加到Nanodrop 载物台上，读取总RNA 浓度，以及260 nm/280 nm 吸收值的比值，2.0 左右被认为纯度较高; 取1 μL 总RNA 备用， 采用Agilent 2100 分析仪进行生物芯片分析，并将浓度、纯度较高的RNA 样品（外泌体及其分泌细胞）交由北京百迈克生物有限公司进行质谱分析，并根据分析结果，选取差异性表达最大的2个miRNAs（miR-199a-3p、miR-214-3p）进行后续 实验。

1.2.5 分别转染miR-199a-3p-mimics和miR-214-3p-mimnics至老龄小鼠BMSCs中以观察衰老状况的改变 将1×105个/mL 浓度的BMSCs 接种至60 mm的培养皿中， 采用10%胎牛血清的α-MEM 培养液培养， 每皿4 mL， 放置于37 ℃培养箱中培养；4 h后，取出培养皿，显微镜下确认细胞贴壁且状态良好，去除培养基并用PBS 清洗，配制转染液：分别添加miR-199a-3p mimics、miR-214-3p mimics，配制成过表达的转染液， 其余各组添加随机序列的对照mimics；分别将转染液添加至培养皿中，每皿4 mL，放入细胞培养箱中培养24 h；转染24 h 后，取出培养皿，去除培养液后PBS 清洗，换成正常培养基，培养3 d 后分别进行qPCR 检测、CCK-8 检测及β-半乳糖苷酶染色分析。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 22 软件进行统计分析，结果以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间差异比较用one-way ANOVA 分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。 2 组间差异比较用独立样本t检验分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 小鼠BMSCs 来源外泌体的鉴定

图1 外泌体鉴定Figure 1 Identification of exosomes

外泌体鉴定方式主要有电镜检测、 粒径检测、表面标志蛋白检测等（图1）。 透射电镜扫描下观察到囊泡为纳米级囊泡，囊泡复染后呈深色，直径在20～200 nm（图1A）；经粒径测量分析所得，囊泡直径均值为146.4 nm，粒径主峰为130.2 nm，直径在20～200 nm 的囊泡百分比为98%（图1B）；流式细胞仪检测囊泡表面标志蛋白CD63 和CD81。 结果显示， 经染色后得到的外泌体表面标志蛋白均呈阳性，阳性率在70%以上（图1C～F）。 上述结果表明，小鼠BMSCs 培养基中分离得到的细胞外囊泡为外泌体。

2.2 老龄小鼠BMSCs 特异性摄取年轻小鼠BMSCs来源的外泌体

将年轻小鼠BMSCs 来源外泌体添加至老龄小鼠BMSCs 的完全培养基中，培养3 h 后，显微镜下观察到老龄小鼠的BMSCs 内开始出现绿色荧光，12 h后，荧光强度显著性增加，几乎所有细胞内都能观察到绿色荧光标记的外泌体，而在对照组的BMSCs中没有出现绿色荧光信号（图2）。结果表明，年轻小鼠BMSCs 来源外泌体以时间依赖性方式被老龄小鼠的BMSCs 特异性摄取。

图2 外泌体绿色荧光标记表达情况Figure 2 Expression of green fluorescent markers in exosomes

2.3 年轻小鼠BMSCs 来源外泌体对衰老BMSCs的影响

将年轻小鼠BMSCs 来源外泌体加入老龄小鼠BMSCs 的完全培养基中，3 d 后进行CCK-8 检测。结果发现，经年轻小鼠BMSCs 来源外泌体作用后的老龄小鼠BMSCs 的增殖能力，与对照组比较，差异具有统计学意义（图3A）；qPCR 检测结果显示，经年轻小鼠BMSCs 来源外泌体作用后的老龄小鼠BMSCs 中衰老基因表达明显下降， 与对照组相比较，差异具有统计学意义（图3B）；β-半乳糖苷酶染色结果显示， 经年轻小鼠BMSCs 来源外泌体作用后，BMSCs 衰老细胞数量明显减少（图3C～D）。以上实验结果说明，年轻小鼠BMSCs 来源的外泌体可有效缓解BMSCs 的衰老状态。

2.4 年轻小鼠BMSCs 来源外泌体和老龄小鼠BMSCs来源外泌体的基因芯片分析结果

我们分别提取了年轻小鼠的BMSCs 来源外泌体（S01）和老龄小鼠的BMSCs 来源外泌体（S02）进行外泌体的基因芯片分析，比较2 组样本间存在差异性表达的miRNAs， 筛选出了2 个表达量较高且表达差异明显的miRNAs， 即miR-199a-3p 及miR-214-3p， 进一步探究这2 个miRNAs 在老龄BMSCs的衰老过程中可能起到的作用（图4）。

2.5 MiR-199a-3p、miR-214-3p 对 老 龄 小 鼠 来 源BMSCs 衰老的影响

图3 年轻小鼠BMSCs 来源外泌体对衰老BMSCs 的影响Figure 3 Effect of young mice BMSCs-exosome on aging BMSCs

根据“2.4”的结果，我们进一步改变老龄小鼠BMSCs 细胞内2 个miRNAs 的表达量， 初步探究miR-199a-3p、miR-214-3p 对老龄小鼠BMSCs 衰老的影响。 利用miR-199a-3p mimics 和miR-214-3p mimics 分别转染老龄小鼠来源的BMSCs 后的CCK-8 检测结果显示：老龄小鼠的BMSCs 内转染miR-199a-3p mimics 后，OD值明显高于对照组，衰老相关基因p16、p53表达也明显下降， 与对照组相比较，差异具有统计学意义，说明miR-199a-3p可能参与了BMSCs 衰老过程的调节；而老龄小鼠BMSCs 内 转 染miR-214-3p mimics 后，OD值 及qPCR 数据与对照组相比较，没有明显差异，说明老龄小鼠来源的BMSCs 内miR-214-3p 含量的增加可能对细胞衰老没有明显的影响（图5）。

图4 BMSCs 来源外泌体miRNAs 热图Figure 4 MiRNAs thermogram of exosomes from BMSCs

3 讨论

衰老是一种普遍存在于生物系统中的退行性过程， 伴随着不可逆的退行性变化和不断增加的疾病敏感性，最终造成死亡[14]。 衰老是人类健康不得不面临的重要问题， 衰老的细胞会分泌一些信号分子，引起各种衰老相关性疾病的发生， 威胁着人类的生命健康。随着年龄的不断增长，机体在形态、结构和生理功能等方面必然会出现一系列全身性的、多方面的退行性变化，如骨质丢失、骨质疏松、骨髓再生能力减弱、机体自我修复功能下降等。 临床上老龄患者因外伤、肿瘤等导致的颌骨缺损，运用常规的骨移植、骨引导再生技术进行修复时， 因老龄化机体存在的全身性、退行性变化，使修复存在一些局限性。 因此，寻找一个既能抗衰老又能促进颌骨修复的治疗方法，具有重要的临床意义。

细胞衰老是指因各种因素而使细胞停滞于G0/G1 期， 无法进入S 期启动染色体复制以完成增殖活动的生理过程[15]。 BMSCs 一旦发生衰老，其成骨分化的能力也将大大降低。 本文研究发现， 经年轻小鼠BMSCs 来源外泌体作用后的老龄小鼠BMSCs， 增殖能力较对照组明显增强， 细胞有继续增殖分化的现象，说明年轻小鼠BMSCs 来源外泌体具有缓解老龄小鼠BMSCs 衰老的作用， 甚至可以说年轻小鼠BMSCs来源的外泌体可以逆转老龄小鼠BMSCs 的衰老状态，使衰老的BMSCs 重新开始分化、增殖。

图5 MiR-199a-3p、miR-214-3p 对老龄小鼠来源的BMSCs 衰老的影响Figure 5 The effect of miR-199a-3p and miR-214-3p on the aging process of BMSCs from old mice

外泌体是细胞在生理或病理状态下分泌的、大小约40～100 nm 的同质性囊泡[16]。 囊泡内含丰富的生物活性物质，它不仅易与邻近细胞膜发生融合，还有部分外泌体能循环进入体内作用于全身系统，由内分泌途径被吸收，将生物活性物质选择性地呈递给受体细胞，调节细胞间的信号传导，发挥生物学功能[17]。 由于外泌体的诸多优点，如良好的耐受性，所载药物在体内可保持一个较长的循环半衰期从而提高疗效； 能穿过细胞膜将承载物质运送至靶细胞；特有的定向归巢能力，并能进行膜修饰从而增强细胞特异性靶向作用；在体内、体外均能加载药物等。 有关外泌体载药治疗的研究在近几年取得了巨大的进展[18]，目前，在心血管疾病[19]、系统性神经性疾病[20]、免疫性疾病[21]、肿瘤[22-23]等方面均有广泛的外泌体载药或外泌体载miRNA 基因治疗的临床研究报道。 本文研究发现，随着小鼠的增龄性变化，BMSCs 来源外泌体内miR-199a-3p、miR-214-3p 的基因表达量也发生了显著性改变， 增加BMSCs 细胞内2 个miRNAs 的表达量后，我们发现增加miR-199a-3p 基因表达可明显缓解BMSCs 的衰老过程。外泌体内含有大量来源细胞的miRNA、 蛋白质、脂质、信号分子等生物活性物质。 结合以上实验结论，我们可以推测，BMSCs 来源外泌体内的miR-199a-3p 极有可能在BMSCs 衰老过程中起到重要的调节作用，但具体机制有待进一步的研究。

综上所述，本文研究结果提示年轻小鼠BMSCs来源的外泌体具有缓解老龄小鼠BMSCs 衰老的作用，探究外泌体及其所含miRNA 在BMSCs 衰老过程中的作用机制，将会为未来运用BMSCs 来源外泌体载miRNA 修复老龄患者颌骨缺损提供理论依据。