外周血白细胞和血浆中EB病毒DNA含量检测的比较

米思蓉，张宁梅，杜伟平，何文婧

(1.延安大学附属医院检验科，陕西 延安 716000；2.榆林市第一医院检验科，陕西 榆林 719000)

EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)是一种嗜人类淋巴细胞的疱疹病毒。从1964年发现EBV至今，被证实与EBV感染所致的疾病越来越多。EB病毒感染早期，患者一般没有临床症状，一旦进入活动期，可累及全身多个脏器，与淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、鼻咽癌等多种疾病有关。EB病毒感染后临床表现多样，容易漏诊、误诊，因此高灵敏度、高特异度的实验室检测方法尤为重要。

检测EBV感染的方法有病毒分离和鉴定、血清学检测和EBVDNA载量检测等[1]。实时荧光定量PCR检测具有高灵敏度、高特异性，是目前临床实验室检测EBV的常用方法。近年来，有学者发现选择不同类型的标本，对EBVDNA定量检测的结果可能产生影响。本研究应用荧光定量PCR技术，检测患者外周血白细胞和血浆中的EBVDNA含量，并对结果进行对比分析，探讨两者EBV含量是否存在差异，为实验室选择标本类型提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2018年1至6月延安大学附属医院423例疑似EBV感染的住院及门诊患者，年龄1月至66岁，男性251例，女性172例。

1.2 仪器与试剂

ABI7500PCR分析仪(美国ABI公司)。EBVDNA检测试剂盒(PCR单管反应体系、标准品、阴性阳性质控品、红细胞裂解液)购自中山大学达安基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本制备 (1)外周血白细胞分离：取出全血标本，充分混匀全血标本，取1 mL红细胞裂解液加入2 mL离心管中，加入800 μL全血标本，充分混匀，12 000 rpm/min离心1 min，去上清液。向沉淀中再加入1 mL红细胞裂解液，充分混匀，12 000 rpm/min离心3 min，去上清液。再加入1 mL生理盐水，12 000 rpm/min离心10 min，去上清液。管底白色沉淀即为分离得到的白细胞，可用于核酸提取。(2)血浆标本制备：取EDTA类抗凝全血离心5 min，吸取上清液，即为血浆。

1.3.2 EB病毒核酸提取 在制备好的外周血白细胞和血浆标本中分别加入50 μL DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10 min。12 000 r/min离心5 min，留取上清液备用。

阴性质控品、临界阳性质控品分别取50 μL，加入50 μL DNA提取液，100℃恒温处理10 min。12 000 r/min离心5 min，备用。阳性定量参考品，混匀后短暂离心备用。

1.3.3 荧光定量PCR定量检测 取PCR反应管n个(n=标本数+1管阴性质控品+1管临界阳性质控品+4管阳性定量参考品)，分别加入处理好的标本、阴性质控品、临界阳性质控品和阳性定量参考品上清液各2 μL，放入PCR扩增仪，开始PCR扩增。扩增程序如下：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10个循环；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30个循环。

1.4 结果判读

根据EBV阳性定量参考品制备的标准曲线判读结果，阳性结果为典型的S型扩增曲线且含量大于1.0×103copy/mL。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，采用配对卡方检验；计量资料以M(P25，P75)表示，采用配对资料的符号秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阳性率的比较

423例患者外周血白细胞检测EBVDNA的阳性率为32.38%(137/423)，外周血血浆检测的阳性率为2.36%(10/423)，经卡方检验，卡方值为127，P<0.05，差异有统计学意义，白细胞的EBVDNA含量阳性率高于血浆(见表1)。

表1 白细胞和血浆检出EBVDNA结果比较(n)

2.2 病毒含量的比较

同为阳性的10例标本，白细胞中EB病毒DNA含量明显高于血浆，经配对秩和检验，统计量Z=-2.803，P=0.005(P<0.05)，差异有统计学意义，白细胞中EB病毒DNA含量高于血浆。且血浆为阳性的标本，白细胞中的EB病毒DNA含量均大于1×105copy/mL，需扩大样本量进一步明确具体的数值(见表2)。

表2 白细胞和血浆EB病毒DNA含量比较(copy/mL)

3 讨论

EBV是较早被识别的人类肿瘤病毒，是多种恶性肿瘤的重要原因[2]，是目前人类已知的8个疱疹病毒中，最容易导致感染的病毒[3]，主要通过唾液和血液传播。EB病毒感染后，首先在口腔上皮细胞内增长繁殖，然后感染局部B淋巴细胞，以环状DNA形式游离于胞浆中，再整合到染色体内，一旦B淋巴细胞大量进入血液循环，即可造成全身性感染。并可长期潜伏于人体淋巴组织中，当机体免疫力低下时，潜伏的EB病毒活化，机体将再次被感染。

EBVDNA水平变化是其感染及活动与否的指标[4]。EBV急性感染初期，只存在于淋巴细胞中，疾病没有发展到细胞裂解程度，故外周血浆中EBVDNA含量极低，当含量低于方法学的检测下限，就不能被检出[5]。EBV可以长期潜伏于淋巴细胞内，故检测外周血白细胞，不仅可以反映现症感染，也可以反映EBV感染潜伏期患者，提高了阳性检出率[6]。但很多血液病患者的外周血白细胞数量和功能都存在异常，这对病毒载量检测有一定影响[7]，为临床诊断带来干扰。而以血浆为检测标本，操作简便，不易受患者白细胞数量和功能的影响，适用于白细胞异常的患者。但血浆EBVDNA含量，在感染两周后开始迅速下降，尤其退烧后可能检测不到，该方法检出病毒多为现症感染，不易发现潜伏期感染者。两种标本检测各有优缺点，且有学者发现，在EBV感染相关疾病中，不同疾病对两种标本的敏感性也不同。如对于EBV感染相关疾病传染性单核细胞增多症、淋巴瘤、自身免疫性疾病、上呼吸道感染和肝功能异常患者，检测淋巴细胞中的EBV更敏感；对于鼻咽癌患者，检测淋巴细胞和血浆中的EBVDNA无明显差异[8]，所以应该结合临床情况，选择更为合适的检测标本。本研究认为，以外周血白细胞为检测标本，比血浆更为灵敏，可以减少漏诊。

本研究结果显示，用荧光定量PCR技术检测外周血白细胞和血浆中EBV核酸载量。外周血白细胞检测的阳性率高于血浆，与赵鸿，等[9]的研究结果基本一致。本次的研究结果还显示当白细胞中EBV的含量达到5次方以上时，血浆中EBV的含量才能被检测出来。可能是因为感染初期，病情尚未发展到细胞裂解并释放EBV进入血液，故血浆中EBV含量低于检测值下限，阳性率较低。本研究结果与王克迪，等[7]的不一致，可能是因为选取的实验对象不一样，而且不同实验室的标本处理、实验过程、仪器试剂也不尽相同。国内各厂商所用工作标准品均为自主定值所得，不同试剂盒的检测结果间可能存在较大差异[10]，使得各实验室间结果缺乏可比性。目前，临床实验室检测患者血液中EBVDNA含量的标本有外周血白细胞、血浆和血清，其中哪一种应作为首选标本，尚存在争论。

随着对EBV的检测越来越深入，EBV感染所致的疾病也越来越被重视，加强对感染者EBVDNA的监测力度，将有利于了解病情的发生、发展，继而改善治疗方案。同时，为了临床医生工作的需要及国内外的学术交流，除了选择合适的检测标本，实现EBVDNA检测的国际标准化也是未来努力的方向。