白藜芦醇对胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢的影响及心肌的保护作用

魏 叶， 朱心瑶， 王 坤， 王志荣

(1.徐州医科大学第一临床学院，徐州 221004;2.徐州医科大学附属医院心内科，徐州 221004)

胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)即机体靶器官对胰岛素的敏感性降低、胰岛素利用障碍，不能发挥正常生物学效应，并导致胰岛β细胞代偿性的分泌胰岛素水平升高，继而出现高胰岛素血症。IR发生后常可导致一系列的糖脂代谢紊乱，靶器官也出现相应的变化。高脂饮食容易导致肥胖、诱发IR，而白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种天然的多酚类抗氧化剂，存在于葡萄，浆果，花生和一些蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[1-3]。研究表明RES是一种核转录因子PPARγ(过氧化物酶增殖物激活受体γ)(peroxisome proliferator-activated receptors γ)的激动剂[4]。基于此，观察RES对IR小鼠的糖脂代谢的影响及通过激动PPARγ改变心肌的变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高脂饲料D12492、对照组饲料D12450B(Research Diets 公司，美国)；RES(Sigma公司，美国)含量>98%；羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose sodium，CMC)(Sigma公司，美国)； 兔抗小鼠PPARγ、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、脂联素(adiponectin，ADPN)多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗、均购自武汉三鹰生物技术有限公司； 羟脯氨酸测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：A030-2-1)；SuperReal荧光定量预混试剂增强版(天根生化科技北京有限公司，Lot S7104)、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技北京有限公司，批号：Lot R7026)。

1.2 试验分组及动物模型的建立

SPF级6 周龄C57BL/6J小鼠40只，雄性，体重 17～19 g，健康，购自济南朋悦试验动物繁育有限公司[许可证号为 SCXK(鲁)2014-0007]；随机分对照组(NC)、高脂组(H)、高脂+CMC组(C)和高脂++CMC+RES组(R),每组10只。NC组以D12450B饲料饲养，另外三组以D12492高脂饲料饲养，每周测量体重。14周后，禁食16 h，剪尾采血行葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test，GTT)试验。

1.3 灌胃干预

RES溶于0.5%CMC中制成混悬液，R组以22.5 mg/(kg·d)的RES灌胃处理，C组以等体积CMC灌胃，每日一次，继续饲养8周，小鼠处死前一周分别进行GTT试验和胰岛素耐量试验(insulin tolerance test，ITT)试验。

1.4 试验取材

禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球取血后脱颈处死，开胸剪取心脏组织迅速置于预冷的磷酸盐缓冲液中冲洗，滤纸吸干，称心脏湿重。部分心脏组织置于液氮速冻后，-80 ℃保存备用。测量胫骨长度。

1.5 血清指标检测

取血后，全血4 ℃静置30 min，4 000 r/min离心10 min，取血清备用。血清送至徐州医科大学附属医院全自动生化分析仪检测血脂、血糖。采用Merck Milliproe 液相芯片试剂盒，按照试剂盒操作步骤检测胰岛素、瘦素、抵抗素、脂联素。

1.6 心肌指标检测

取左心室心肌依照羟脯氨酸测试盒说明书操作检测羟脯氨酸。western-blot(WB)方法检测心肌PPARγ、TNF-α、ADPN、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的蛋白水平以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PPARγ、TNF-α、ADPN、心房利钠肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)、β-肌球蛋白重链(β-Myosin heavy chain，β-MHC)的mRNA,引物序列如表1所示。

表1 各基因的引物序列Table 1 Primer sequences of gene

1.7 统计方法

2 试验结果

2.1 动物存活及模型情况

小鼠喂养14周行GTT试验，以对照组GTT试验结果平均曲下面积(area under the curve，AUC)为基准，剔除三组高脂组中AUC低于对照组平均值的小鼠。H组2只，C组3只，R组1只。灌胃干预7周行ITT试验。

2.2 各组小鼠一般情况

2.2.1 小鼠的体重变化

RES干预后，与NC组相比，H及C组体重仍呈升高趋势，而R组趋势明显减缓，如图1(a)所示。试验结束时，H及C组体重与NC组相比P<0.01；R组较H减轻，P<0.01,如图1(b)所示。

2.2.2 各组小鼠的一般情况

高脂喂养的三组小鼠全心重量(heat weight,HW)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin，FIN)水平及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)均高于NC组，但胰岛素水平差异无统计学意义。R组的体重及空腹血糖水平明显改善，HW(P<0.01)、FBG(P<0.05)，如表2所示。

注：与NC组比较，**表示P<0.01；与H组比较,##表示P<0.01。下同。图1 小鼠体重变化Fig.1 Changes of mice weight

表2 各组小鼠的一般情况Table 2 General conditions of mice in each

注：HOMA-IR=(FBG×FIN)/22.5；与NC组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01; 与HDF组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01。下同。

2.3 RES对糖脂代谢的影响

2.3.1 RES对糖耐量及胰岛素耐量的影响

小鼠灌胃7周左右分别行GTT试验及ITT试验。高脂饲养的三组小鼠均出现糖耐量受损，而R组GTT及ITT试验曲下面积明显低于H及C组，P<0.01，图2所示。

图2 ITT及GTT试验结果Fig.2 The results of ITT and GTT

2.3.2 血清血脂及血糖情况

高脂饲养H及C组小鼠的血糖、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)均高于NC组，P<0.01；而RES干预8周后减轻了该趋势，P<0.05。而甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的变化无统计学意义,如表3所示。

表3 各组小鼠的血脂情况Table 3 Blood lipids of mice in each

2.3.3 血清激素变化情况

与NC组相比，小鼠血清中瘦素、抵抗素在H及C组均升高趋势，而与H组相比，RES干预后两种激素的血清水平呈下降趋势，但无统计学意义。而ADPN血清水平无明显变化，如表4所示。

表4 小鼠血清中脂肪因子变化情况Table 4 Changes of adipokine in serum of mice

2.4 小鼠心肌变化

2.4.1 心脏重量/胫骨长度比

与NC组小鼠比较，H和C组小鼠的心脏重量/胫骨长度比值明显升高，而RES干预后较H组明显下降，P<0.01，如图3所示。

与H组比较，##表示P<0.01。下同。图3 小鼠心脏重量/胫骨长度比Fig.3 Heart weight/Tibial length ratio in mice

2.4.2 心肌中ANP、BNP、β-MHC的mRNA的表达

H组与C组的ANP、BNP、β-MHC的mRNA的表达水平明显高于NC组；而在R组小鼠心肌中的表达水平呈下降趋势，P<0.01或P<0.05，如图4所示。

图4 心肌中ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达Fig.4 The mRNA of ANP,BNP and β-MHC in myocardium

2.4.3 心肌中羟脯氨酸含量

按羟脯氨酸测试盒说明书操作测定心肌中羟脯氨酸含量，H及C组小鼠每克心肌组织中羟脯氨酸含量均高于NC组，P<0.01；R组单位心肌的羟脯氨酸含量也高于NC组，P<0.05,但较另两组明显下降，P<0.05，如图5所示。

图5 心肌中羟脯氨酸含量Fig.5 The content of hydroxyProline in myocardium

2.4.4 心肌中的胶原蛋白表达

与NC组比较，H与C组小鼠心肌中Ⅰ型胶原(collagenI)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ)蛋白表达水平均升高，P<0.01,且R组胶原水平均呈下降趋势，见图6(a)～图6(c)。

图6 心肌中Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白条带及蛋白表达Fig.6 Protein bands and expression of CollagenI,CollagenⅢ in myocardium

2.4.5 心肌中PPARγ、TNF-α、ADPN的mRNA及蛋白表达

PCR及WB方法检测心肌中相关基因的mRNA与蛋白的表达水平。与NC组相比，PPARγ、ADPN的mRNA水平在H及C组均降低，TNF-α则在H及C组明显升高，P<0.01或P<0.05，如图7所示。而与H组相比，R组的PPARγ、ADPN的mRNA水平升高，TNF-α降低。同时蛋白表达水平呈相同趋势，如图8所示。

图7 心肌中PPARγ、ADPN和TNF-α 的mRNA表达Fig.7 The mRNA of PPARγ,ADPN and TNF-α in myocardium

图8 心肌中PPARγ、ADPN和TNF-α的蛋白条带及蛋白表达Fig.8 Protein bands and expression of PPARγ,ADPN and TNF-α in myocardium

3 分析及讨论

RES 是一种非黄酮类多酚化合物，广泛存在于水果、葡萄酒、虎杖等植物中的一种多酚类物质，因“法国悖论”现象引起关注，可抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化等发挥心血管保护作用。前期已证实RES可以抑制心房重构、减轻心房纤维化、减轻房颤氧化应激损伤等[5-7]。有研究表明RES是一种PPARγ的激动剂[4]，当干预剂量为22.5 mg/(kg·d)时，降低小鼠血脂的作用最为明显[8]，故RES的干预剂量定为22.5 mg/(kg·d)。试验中，小鼠经高脂饲养14周后GTT与ITT试验后测得的AUC较对照组明显升高，且HOMA-IR也明显升高、均>2.5,提示小鼠达到IR标准。

3.1 RES影响IR小鼠糖脂代谢

研究发现，高脂饲养的小鼠出现体重增加、TC及LDL水平明显升高，TG的血清水平也呈升高的趋势。同时血清中胰岛素、瘦素、抵抗素的水平也有所升高，但差异无统计学意义。而RES干预后血清中的血脂及脂肪因子升高水平均有所缓解。另外，R组GTT及ITT试验的AUC呈下降的趋势，且FBG水平明显降低，表明RES可以改善IR小鼠的糖脂代谢紊乱。

3.2 RES对IR小鼠心肌的保护作用

研究发现高脂饲养的小鼠心肌组织中BNP、ANP、β-MHC的mRNA水平明显升高，且心脏重量/胫骨长度比值升高，提示IR小鼠存在心肌肥厚的表现。羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分之一，其含量反映了胶原组织含量及纤维化程度，经检测高脂饲养小鼠的羟脯氨酸水平升高，且WB检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的蛋白表达明显升高，表明IR小鼠心肌出现了纤维化表现。RES干预后心肌纤维化水平有所减轻。

3.3 RES对IR的心肌作用的机制探讨

PPARγ是一类核转录因子，在多在脂肪组织中表达，但在心肌组织中也有少量表达。它在体内与视黄醇类X受体(retinoid X receptor，RXR)形成异二聚体，结合于靶基因启动子的PPAR反应元件(PPREs)调控靶基因的转录[9]。噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)药物在糖尿病治疗中通过激动PPARγ增强外周组织的胰岛素敏感性，改善IR，如吡格列酮、罗格列酮等。但此类药物常导致体重增加，水肿，心衰等副作用。研究中，IR小鼠出现PPARγ的mRNA及蛋白表达水平明显降低，同时激活了炎症因子TNF-α的表达，而ADPN的表达水平下降。但RES干预后该趋势明显改善。RES作为PPARγ的激动剂，在高脂饲养IR小鼠心肌组织中激活PPARγ,使其与RXR形成异二聚体作用于TNF-α的PPREs上抑制TNF-α的转录，从而减轻了TNF-α对ADPN的抑制作用，使心肌组织的ADPN表达水平升高。Iwaki等[10]发现ADPN的启动子中含有PPRE的位点，PPARγ激活剂能诱导ADPN的启动子，使其活性升高5～10倍。PPARγ激活剂通过增强ADPN mRNA的稳定性，促进ADPN蛋白的合成、释放，降低组织TNF-α水平，减轻TNF-α介导的对ADPN表达的抑制作用[11]。研究表明ADPN与IR所致的心室重构关系密切，给予外源ADPN可以减轻IR，进而改善心室重构[12]。推测低水平 ADPN诱发心室重塑的机制可能是：①ADPN水平降低，引起炎症因子因子TNF-α释放增加，加重IR的程度;②低水平ADPN可以通过抑制AMPK信号通路促进活性氧(reactive oxygen sepcies，ROS)诱导的心室重构[13]；③ADPN水平降低时，使外周血管紧张素激活，增加心脏负荷，进而促进心肌细胞的肥厚与增殖[14]。 因此，RES可能是通过激动PPARγ，调节炎症因子TNF-α、脂肪因子ADPN水平以及两者之间的相互作用，减轻了心肌肥厚及纤维化改变。研究结果为RES应用于治疗IR引起的机体代谢紊乱提供了更多科学依据，也为RES在预防糖尿病心肌病的发生方面提供了理论支持。

4 结论

高脂饮食可以诱导小鼠产生胰岛素抵抗，导致小鼠糖脂代谢紊乱。RES对胰岛素抵抗小鼠的糖脂代谢紊乱有调节作用，并且可以减轻胰岛素抵抗小鼠的心肌肥厚及纤维化，具有心肌保护作用。这种心肌保护左右有可能是通过激动PPARγ调节ADPN、TNF-α来实现的。