积热饲料喂食联合洛哌丁胺灌胃制作胃肠积热证大鼠模型的优化与验证

封聪，殷晨晖，金维缘，王思映，张巍伟，姜泓

中国医科大学公共卫生学院，沈阳110122

胃肠积热证属于中医阳明病热证范畴[1]，主要由膳食结构不平衡所致，其中喜食肥甘厚味、辛辣燥烈之品等是引起积热内蕴的主导因素。随着社会的不断发展，饮食结构的变化和生活节奏的加快，胃肠积热成为临床常见证型，尤其是儿童、青少年及青年女性。中医动物模型的确立是中医药经典理论研究、药效学评价的前提条件，是现代中医药事业发展的重要环节[2]。因此，建立胃肠积热证动物模型成为目前亟待解决的问题。已有研究结果表明，以积热饲料喂食大鼠可建立胃肠积热证动物模型，但大便干结不明显；洛哌丁胺是一种常见的止泻药，用以联合建模或可导致大便干结，使模型更符合胃肠积热证候特点。2018年12月～2019年4月，我们采用三因素三水平正交设计的方法，以积热饲料喂食时间、洛哌丁胺给药剂量、洛哌丁胺给药时间为主要因素，以舌色、粪便性状、尿液颜色、肠鸣音、冷热趋向性、体温的宏观表征作为考察指标，优化胃肠积热证大鼠模型的实验条件并加以验证，以期为中医药治疗胃肠积热证提供良好的实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 实验动物：健康SPF级雌性SD大鼠80只，3周龄，体质量50～60 g，由中国医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(辽)2013-0001。主要仪器：ZH-6C型智能冷热板测痛仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)，家用、医用两用听诊器(上海鱼跃医疗设备有限公司)，动物舌相数字化诊疗系统(实验室自制)，大鼠代谢笼(安徽正华生物仪器设备有限公司)，BAT-12微探针温度计(美国Physitemp公司)。主要试剂：全脂甜奶粉(黑龙江红星集团食品有限公司)，炭烤马面鱼片(台州石塘小渔村电子商务有限公司)，小麦粉[中粮面业营销管理(北京)有限公司]，纯豆粉(南方黑芝麻集团股份有限公司)，将鱼片、全脂甜奶粉、小麦粉、纯豆粉按1∶1∶1∶2制成积热饲料[3，4]；异氟烷(一品制药)，洛哌丁胺胶囊(生产批号601R01，上海朝晖药业有限公司)。

1.2 胃肠积热证大鼠模型实验条件的优化

1.2.1 动物分组与造模条件 适应性饲养1周后，取60只大鼠随机分为10组，每组6只。第1～9组用于胃肠积热证模型三因素三水平正交设计实验，积热饲料喂食时间(A)分别为4、8、12周，洛哌丁胺灌胃剂量(B)分别为3、6、12 mg/kg(以生理盐水为混悬介质)，洛哌丁胺灌胃时间(C)分别为实验结束前5、10、15 d，正交试验安排见表1。每周记录大鼠体质量2次，调节灌胃剂量。第10组作为对照组，正常饲料饲养，生理盐水灌胃。另外20只大鼠用于正交设计实验的验证实验。整个实验过程中使用专用笼具、专用垫料，自由摄食、饮水，室温保持20～25 ℃，相对湿度控制在40%～70%，保证光照12 h/d，昼夜循环饲养。实验过程完全遵循实验伦理学要求，尽量减少动物的使用量，并最低限度减少动物痛苦。

表1 胃肠积热证大鼠模型正交试验安排

注：A为积热饲料喂食时间，1、2、3分别为4周、8周、12周；B为洛哌丁胺灌胃时间，1、2、3分别为实验结束前5 d、10 d、15 d；C为洛哌丁胺灌胃剂量，1、2、3分别为3 mg/kg、6 mg/kg、12 mg/kg；D为空白因素，1、2、3均相等。

1.2.2 胃肠积热证大鼠模型的宏观表征指标观察 分别在首次给予洛哌丁胺前及末次给药24 h后，依据文献和《大鼠/小鼠辨证论治实验方法学》，从胃肠积热证诊断标准中选取舌色、尿液颜色、粪便性状、肠鸣音、冷热趋向性、体温等作为宏观表征观察指标。

1.2.2.1 舌色 大鼠麻醉后，采用舌相照相分析系统拍摄大鼠舌面，记录红色、绿色、蓝色像素值[5]，综合评价舌体颜色变化。

1.2.2.2 尿液颜色 收集大鼠尿液4 h，精密吸取0.5 mL，置于96孔板中；于足够光照强度的固定光源下，以空白滤纸为背景，拍摄照片；用Photoshop图片处理软件，记录蓝色像素值，像素值越低则尿液颜色黄色程度越重。

1.2.2.3 粪便性状 采用布里斯托大便性状量表对大鼠粪便性状量化评分，如评分不同则重新评分[6]。评分越低粪质越软，越高则粪质越硬。

1.2.2.4 肠鸣音 大鼠麻醉后，用听诊器计数大鼠5 min内的肠鸣音次数，次数减少为肠蠕动下降。

1.2.2.5 冷热趋向性 训练阶段：冷热板温度为室温(25 ℃)，训练3 d，1次/d，每次3 min。测定阶段：观察大鼠5 min内在低温板(15 ℃)和高温板(40 ℃)停留的时间[7]，判定其冷热趋向性。

1.2.2.6 体温 将大鼠体温计探头插入大鼠肛门，测定直肠温度。

1.3 胃肠积热证大鼠模型的宏观表征指标权重系数分配 按宏观表征中舌相(红、绿、蓝)、尿色、粪便、肠鸣音、冷板趋向性、直肠温度的权重系数依次为3(1∶1∶1)∶1∶3∶3∶3∶3，综合评分总分16分。将各项指标的最终得分进行加和，为该组动物模型的最终得分。

1.4 胃肠积热证大鼠模型实验条件优化后的验证 将用于验证实验的20只大鼠随机分为两组各10只，模型组采用优化后的实验条件制作胃肠积热证大鼠模型，对照组常规饲养、生理盐水灌胃。按照1.2.2的方法观察各项宏观表征指标，判定是否符合胃肠积热证诊断标准[8]。

2 结果

2.1 不同胃肠积热条件下各组大鼠宏观表征比较

2.1.1 各组大鼠舌色比较 给予洛哌丁胺前，与对照组比较，第1～9组大鼠舌色中三种颜色像素值升高，第4、5、6组大鼠舌色中绿色和蓝色像素值升高(P均<0.05)；给予洛哌丁胺后，第9组大鼠舌色中红色像素值降低(P<0.05)，第1～6组大鼠舌色中三种色像素值升高而第7、8组降低，但差异无统计学意义。见图1。

注：A、B、C分别为给予洛哌丁胺前舌色的红色、绿色、蓝色像素值变化；D、E、F分别为给予洛哌丁胺后舌色的红色、绿色、蓝色像素值变化；与对照组比较，*P<0.05。

2.1.2 各组大鼠尿液颜色比较 给予洛哌丁胺前，与对照组比较，第1～9组大鼠尿液蓝色像素值降低，第1～5组差异有统计学意义(P均<0.05)；给予洛哌丁胺后，第2、3组大鼠尿液蓝色像素值降低(P均<0.05)，第9组大鼠尿液蓝色像素值升高，但差异无统计学意义。见图2。

2.1.3 各组大鼠粪便性状评分比较 给予洛哌丁胺前，与对照组比较，第1～9组大鼠粪便性状评分下降，第1组差异有统计学意义(P<0.05)；给予洛哌丁胺后，各组大鼠粪便变硬，第3、6、9组粪便性状评分升高(P均<0.05)。见图3。

2.1.4 各组大鼠肠鸣音次数比较 给予洛哌丁胺前，与对照组比较，除第3组外，其余各组肠鸣音次数减少(P均<0.05)；给予洛哌丁胺后，除第4、6组外，其余组肠鸣音次数减少(P均<0.05)。见图4。

注：A为给予洛哌丁胺前尿液颜色中蓝色像素值变化；B为给予洛哌丁胺后尿液颜色中蓝色像素值变化；与对照组比较，*P<0.05。

注：A为给予洛哌丁胺前粪便性状评分变化；B为给予洛哌丁胺后粪便性状评分变化；与对照组比较，*P<0.05。

注：A为给予洛哌丁胺前肠鸣音次数变化；B为给予洛哌丁胺后肠鸣音次数变化；与对照组比较，*P<0.05。

2.1.5 各组大鼠冷热板趋向性比较 给予洛哌丁胺前，与对照组比较，第4～6组大鼠在低温区域停留时间有增加趋势，其中第5组差异有统计学意义(P<0.05)；洛哌丁胺干预后，第2～9组大鼠在低温区域停留时间增加，差异有统计学意义(P均<0.05)。见图5。

注：A为给予洛哌丁胺前在低温区域停留时间变化；B为给予洛哌丁胺后在低温区域停留时间变化；与对照组比较，*P<0.05。

2.1.6 各组大鼠体温比较 给予洛哌丁胺前，与对照组比较，第4～6组大鼠直肠温度升高，第7～9组差异有统计学意义；给予洛哌丁胺后，第3、7组大鼠直肠温度升高(P均<0.05)。见图6。

注：A为给予洛哌丁胺前直肠温度变化；B为给予洛哌丁胺后直肠温度变化；与对照组比较，*P<0.05。

2.2 胃肠积热证大鼠模型实验条件优化的正交设计实验结果 三种因素对综合评分影响强弱依次为洛哌丁胺灌胃时间(R=3.36)、洛哌丁胺灌胃剂量(R=1.54)、积热饲料喂食时间(R=1.49)，积热饲料喂食时间中8周(K2=11.95)﹥12周(K3=11.05)﹥4周(K1=10.45)，洛哌丁胺灌胃剂量中12 mg/kg(K3=13.20)﹥6 mg/kg(K2=10.42)﹥3 mg/kg(K1=9.84)，洛哌丁胺灌胃时间10 d(K2=12.12)﹥5 d(K1=10.75)﹥15 d(K3=10.58)。因此，胃肠积热证大鼠模型最优实验条件为积热饲料喂食时间8周、洛哌丁胺灌胃剂量12 mg/kg、洛哌丁胺灌胃时间10 d。见表2。

表2 肠积热证大鼠模型实验条件优化的正交设计实验结果

2.3 胃肠积热证大鼠模型实验条件优化后的验证结果 与对照组比较，模型组大鼠舌色中红色、绿色、蓝色像素值降低，尿液中蓝色像素值降低，粪便性状评分升高，肠鸣音次数减少，在低温区域停留时间延长，直肠温度升高(P均<0.05)，完全符合胃肠积热证诊断标准。见表3。

表3 模型组和对照组大鼠宏观表征比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

胃肠积热证是因无形热邪或有形热结所致的胃肠阳热偏盛状态[9]，临床主要表现为恶热、易汗出、口臭、口渴喜凉饮、大便干结、小便黄、舌红、苔黄厚、脉滑数等里热实证。本证可见于各年龄段的患者，尤其多见于儿童及青少年，小儿食积内热证的症状多为嗜食肉食、乳类等。此外，流行病学调查结果显示，便秘患者中年轻女性占比略高于男性，且随年龄增长，差异逐渐减少[10，11]。因此，本研究以初断乳雌性大鼠为实验对象，以舌色、尿液颜色、粪便性状、肠鸣音、冷热板趋向、直肠温度作为考察指标，建立胃肠积热大鼠模型。

本研究以北京中医药大学谷晓红团队所提供的积热饲料处方喂食大鼠。在造模过程中，各组大鼠均有不同程度的食量降低、腹围增大、体质量增加缓慢，大便间隔长、粒数减少且黄臭，小便色黄，舌暗红、肛门红肿等症状，但大便干结症状并不明显。我们考虑到胃肠积热证是阳明经证和阳明腑证二者形成的“证前阶段”，为防止过长时间喂食积热饲料导致积热证转变，本研究选择洛哌丁胺进行干预，以加速积热证的形成。洛哌丁胺是常见的治疗腹泻用药[12]，干预后大鼠表现出明显的大便干结症状，并且胃肠积热证的表征进一步加重。因此，本研究对积热饲料喂食时间、洛哌丁胺给药时间和洛哌丁胺给药剂量三因素进行了考察，以期得到最佳胃肠积热证大鼠模型的建立条件。

正交设计是一种可以广泛用于各研究领域中对多因素多水平进行研究的设计方法[13，14]。这种设计方法是从全面实验中依据正交性选取具有代表性的实验进行考察。与全因素全水平的全搭配设计相比，可减少实验次数，节约成本，提高实验效率，可快速筛选出最优的实验条件。胃肠积热证的主要病因是内热郁积于体，因此，本研究主要从积和热的两方面采用正交设计的方法，将积热饲料的喂食时间、洛哌丁胺给药剂量、洛哌丁胺给药时间作为考察因素，进行三因素三水平正交试验。

成功的中医证候模型必须满足两个条件:一是拟定的干预因素应是所造证候的主要影响因子，二是采用的拟定干预因素所致的病理变化应当是所造的证候[8]。本研究主要从胃肠积热证的“胃肠蓄热，阻滞而积，郁久化热”病因出发，采用积热饲料联合洛哌丁胺的方法模拟胃肠积热证的发病条件，并运用动物行为学及图像采集技术等现代医学诊断技术将中医证型中的描述性指标进行量化对比，以期能够更全面、系统、准确地评价胃肠积热证大鼠模型。为验证所建胃肠积热证大鼠模型的准确性和可靠性，本研究将第1～9组所有指标与对照组进行比较，以更好地观察模型宏观指标的变化及稳定情况；同时将给予洛哌丁胺前后的所有指标进行比较，以更好地观察在造模过程中洛哌丁胺的作用及对大鼠宏观指标的影响。

舌诊是观察患者舌质和舌苔变化以诊察疾病的方法，是中医望诊的重要内容。本实验发现，胃肠积热证大鼠的舌相与对照组比较有明显差异，积热饲料喂食4周时，第1～9组大鼠舌色变为鲜红，符合中医诊断学中红舌主实热的临床意义[15]。其病机是热使血的循行加速，舌体脉络充盈[5]。给予洛哌丁胺后，舌色中红色、绿色像素值下降，蓝色像素值相对升高，舌色也由红色发展为深红至绛红色，是胃肠积热证典型的阳热症状[9]。饲养8周时，大鼠舌相鲜红色最明显，继续饲养至12周时，鲜红色减退。大鼠在洛哌丁胺干预后均呈绛红舌，表明洛哌丁胺对大鼠舌色影响较显著，可用于构建胃肠积热动物模型。

尿液颜色是反映机体健康状况的重要观测指标，对尿液“发黄”症状进行诊断时，主要分析尿液颜色中蓝色像素值。积热饲料饲养4周后，大鼠尿液已由浅黄或无色变至深黄色；但12周时，在给予洛哌丁胺灌胃后“黄尿”的症状稍解，可能由于随积热症状逐渐加重，大鼠阴液匮乏，渴喜冷饮，饮水量增加所致，具体原因有待于进一步研究。

胃肠积热证主要由饮食不节或过食肥甘厚味引起，由于运化不利，使饮食积于胃肠之中，日久不化，阳气内郁，蕴而化热，形成胃肠积热之证[16]。我们采用积热饲料饲养大鼠4周后，大鼠粪便性状评分有下降的趋势，排泄物以断边光滑的柔软块状黄臭粪便为主，且肛门污秽。为加强内热之“积”的作用，本研究采用洛哌丁胺干预，使粪便的性状评分显著升高，引起大鼠大便干燥，用以模拟胃肠积热证阳气内郁、蕴于胃肠的发病机制。

肠鸣音是由于肠蠕动造成肠内容物之间以及肠内容物与肠壁间摩擦、撞击产生的声音，从肠壁可传导至腹壁[17]。肠鸣音作为人体常见生理信号，可用于肠道相关疾病的诊断。目前，临床最常用的肠鸣音诊断方法是用听诊器听诊，因此本研究在保证听诊环境安静的前提下，尽量减少运动所造成的影响，并延长听诊时间至5 min，以观察大鼠肠蠕动情况。结果表明，喂食积热饲料后各组大鼠的肠鸣音次数减少，说明长期食用积热饲料易引起胃肠运动功能障碍[18]，肠蠕动减弱，内容物推进缓慢，进而引起排便间隔延长、排便量少等症状[19]。给予洛哌丁胺后，大鼠的肠鸣音次数降低，与各组给予洛哌丁胺之前相比，第5、7、8、9、组大鼠肠鸣音次数增加，但差异不显著。这表明造模初期洛哌丁胺可使大鼠肠鸣音次数减少；但随造模时间增加，洛哌丁胺对肠鸣音的影响逐渐减弱，提示洛哌丁胺应在8周时给予，此时洛哌丁胺的造模效果优于12周。

恒定的体温是保证新陈代谢和生命活动正常进行的前提，也是临床查体的重要体征之一。第4～9组大鼠直肠温度较对照组升高，且行为学实验表现为在低温区域停留时间延长，具有明显的恶热趋冷性，是典型的积热证表现。这可能是由于机体处于病理状态下所激发出的内生致热物质作用于机体的生理或病理反应[7]，或是由于积食长时间积于肠内，肠蠕动推进功能减弱，引起肠道内菌群失调所致炎症而导致的体温升高，具体原因尚有待于进一步研究。

正交设计实验的结果显示，积热饲料喂食8周、洛哌丁胺给药剂量12 mg/kg、持续给药10 d是胃肠积热证大鼠的最佳造模条件。本研究对所得最佳模型条件进行验证，结果表明，与对照组相比，模型组大鼠舌色、尿色、粪便性状、肠鸣音、冷热板趋向、直肠温度等指标均发生明显变化，且稳定可重复，表明胃肠积热证大鼠模型造模成功。因此，积热饲料喂食8周、洛哌丁胺12 mg/kg持续给药10 d可以成功构建大鼠胃肠积热模型。