急性乙型肝炎患者pDCs上CD86表达变化及意义

王晓玲，沈丽贤，李惠文，张亚芹，李 瑶，吴书娜

(河北中医肝病医院 二病区，河北 石家庄 050800)

据世界卫生组织(WHO)统计，全球约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者，大大增加了肝硬化和肝癌的发生概率。人体的免疫反应与HBV的相互作用对宿主的临床结局起着决定性作用，病毒清除需要辅助性T细胞(T helper,Th)和细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的激活，发挥有效作用。有学者认为，HBV-特异性T细胞的功能缺陷让HBV感染慢性化[1]，其功能缺陷的原因仍不是很清楚。作为重要的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)，树突状细胞(dendritic cells,DC)能有效激活T细胞反应，对临床结局起重要作用，尤其是HBV感染初期[2-4]。DC分为髓样DC(mDC)和浆细胞样DC(pDC)：mDC主要发挥抗原提呈作用；pDC则可以产生大量Ⅰ型干扰素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)，协助激活固有免疫反应和适应性免疫反应，在抗HBV免疫反应中起着中枢性的作用[5-7]。外周血pDCs在慢性乙型肝炎(chornic hepatitis B,CHB)患者中虽然数量没有改变，但表型和功能均有受损[8]。有关pDCs在急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)患者中的变化及作用研究较少，其具体作用机制尚不清楚。DC 细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例很小，其发挥免疫作用主要是通过分泌Ⅰ型干扰素或细胞因子，DC 在适应性免疫过程中作为抗原提呈细胞，活化 T淋巴细胞参与抗病毒过程。DC与NK细胞之间还同时存在相互作用[9]，即NK细胞调节 DC的分化方向，DC分泌细胞因子促进NK细胞活化。本研究纳入AHB患者40例，采用酶联免疫方法及细胞流式技术进行研究，旨在探讨pDCs在AHB患者临床转归中的变化及作用，现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象 2015年6月-2017年5月于医院就诊的急性乙型肝炎(AHB)患者40例，男12例，女28例，年龄21～71岁，平均(59.5±7.1)岁。①诊断标准：参考《病毒性肝炎防治方案》[7]，患者感染HBV前(>6月)无乙型肝炎病史，感染后出现AHB临床症状，HBsAg阳性、HBV-DNA阳性、HBc-IgM阳性、肝功能异常。②纳入标准：患者年龄18～75岁，性别不限，诊断符合AHB诊断标准，首次确诊病例，未接受过抗病毒药物治疗及免疫治疗，患者依从性好，能完成相关检查。③排除标准：年龄<18岁或>75岁，合并其他病毒性肝炎，HIV感染，药物性、酒精性及自身免疫性肝炎，合并其他系统器官严重疾病，合并肿瘤、免疫相关疾病等，合并精神疾病或癫痫，妊娠期或哺乳期女性，依从性差，不能完成全部检查项目。另纳入基线资料匹配的同期健康体检者26例为健康对照组(health control,HC)，其中男6例，女20例，年龄24～71岁，平均(55.2±6.3)岁。2组受试者性别、年龄等基本临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，全部受试者均知情同意并签署知情书。

1.2治疗方法 AHB患者入院确诊后均嘱其充分休息、合理饮食、适当增加营养，并根据病情给予退黄、降酶、保肝等对症治疗，改善肝脏微循环，促肝细胞生长素治疗，部分患者给予人血白蛋白注射液等对症支持处理，预防患者病情重症化或慢性化，综合病情给予核苷类似物，全部患者应用恩替卡韦分散片(江苏正大天晴药业股份有限公司生产)0.5 mg空腹口服，1次/d。

1.3检测指标与方法 健康体检者在体检当日清晨、AHB患者在住院次日及治疗6周后清晨空腹抽取静脉血5 ml,应用贝克曼库尔特离心机以2 000 r/min离心5 min，取上清液，置于-70 ℃冰箱保存待测，由检验科医师按试剂盒操作说明书进行各项指标检测。

1.3.1HBV DNA、HBsAg、HBeAg及肝功能检测 取血液标本2 ml，HBV DNA定量检测采用荧光定量PCR法，在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,再通过标准曲线对未知模板进行定量分析，试剂盒购自湖南圣湘生物科技有限公司。HBsAg、HbeAg等乙型肝炎标志物采用电化学发光法(ECL)进行定量检测，HBsAg正常参考值0～0.08 IU/ml,HbeAg正常参考值0～1 S/CO，试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，应用Elec-sys2010电化学发光免疫分析仪进行检测。并根据治疗前后检测结果计算HBV DNA转阴率、HBsAg清除率、HBeAg血清学转换率。

1.3.2外周血pDCs检测 取血样标本200 μl分别加入Lin1-FITC 3 μl，HLA-DR-PerCP 3 μl，CD123-APC 3 μl，CD86-PE 5 μl，室温避光染色，加入红细胞裂解液，应用PBS缓冲液洗涤细胞2次，参照试剂盒说明书加入荧光标记的相应抗体(均购自美国RD公司)，避光结合30 min后，置于冰上待检。使用MDL-Flow流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司生产)完成检测，利用微球定量，根据流式细胞仪测定时制作的标准曲线，计算出pDCs表面CD86分子的绝对计数(CD86ABC)。全部过程严格按照试剂盒说明进行操作。

2 结 果

2.1AHB患者治疗前后肝功能指标比较 治疗6周后，AHB患者肝功能指标明显改善，与治疗前比较，差异均有统计学意义(P均<0.01),见表1。

表1 AHB患者治疗前后肝功能指标比较

2.2AHB患者治疗前后乙型肝炎标志物水平比较 治疗6周后，AHB患者乙型肝炎标志物水平明显下降，与治疗前比较，差异均有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 AHB患者治疗前后乙型肝炎标志物水平比较

2.3HBV DNA转阴率、HBsAg清除率、HBeAg血清学转换率变化 治疗6周后，AHB患者HBV DNA转阴率为82.5%，HBsAg清除率为72.5%，HBeAg血清学转换率为75.0%，与治疗前比较，差异均有统计学意义(P<0.01),见表3。

2.4外周血pDCs频数比较 治疗前HC组与AHB组外周血单个核细胞(PBMC)比较差异无统计学意义，而AHB组治疗后PBMC频数显著低于治疗前。HC组外周血pDCs频数显著高于AHB组治疗前，而AHB组治疗后与治疗前pDCs频数比较差异无统计学意义，见图1。

表3 AHB患者治疗后HBV DNA转阴率、HBsAg清除率、HBeAg血清学转换率比较[例(%)]

2.5CD86+pDCs频数比较 治疗前HC组与AHB组CD86+pDCs频数比较，差异无统计学意义，AHB组治疗后CD86+pDCs频数显著高于治疗前。HC组CD86ABC显著低于AHB组治疗前，而AHB组治疗后与治疗前CD86ABC差异无统计学意义，见图2。

3 讨 论

急性乙型肝炎多数呈自限性过程，预后一般良好，临床上一般无需抗病毒治疗，但仍有 5%～10%的患者会发展为慢性乙型肝炎，导致病情迁延，影响患者预后。因此对可能会演变为慢性乙型肝炎的AHB患者应及时进行抗病毒及免疫调节治疗，以减少其转变为慢性肝炎[10-11]。另有研究表明，对于少数急性乙型肝炎患者，经相应治疗后肝功能正常或基本正常，HBV DNA或HBsAg滴度降低，或者行肝组织病理检查发现病变时，还应积极进行干扰素或胸腺肽治疗，以清除病毒，加快乙型肝炎标志物的血清学转换[12-13]。本研究中，AHB患者治疗6周后 HBV DNA转阴率为82.5%，HBsAg清除率为72.5%，HBeAg血清学转换率为75.0%，均取得了较好的疗效。

在慢性HBV感染患者，免疫控制对病毒的清除至关重要，但HBV也进化出了相应的机制去逃避免疫系统的清除。HBV虽然激活了人体的免疫系统，但可以逃避甚至破坏人体免疫系统，具体机制尚不十分明确。受多种因素影响，不同HBV感染者的临床结局往往不同[14-15]。在众多参与抗HBV免疫反应细胞里，pDCs发挥着中枢性的作用。pDCs可以通过TLRs(Toll like receptors)直接识别HBV的核酸、单链RNA以及未甲基化的DNA。TLRs(TLR7和TLR9)一经触发，pDCs不但能快速、大量的产生IFN-Ⅰ，而且可以产生其他的细胞因子如TNF-α(tumor necrosis factor)、IL-6(interleukin)以及细胞表面共刺激分子[16-17]。这些细胞因子即可以直接抑制HBV的复制，而且还可以激活自然杀伤(NK)细胞及T细胞，激活和调控抗病毒免疫，间接发挥清除HBV的作用。另外，pDCs还可以直接从被感染的细胞中识别和提成HBV抗原[18-19]。

国内外多项基础研究对DC在乙型肝炎动物模型中的作用及可能机制进行了分析探讨，但目前临床应用还较少，这是由于此类治疗方法尚不能达到预期的清除病毒疗效，还有学者研究发现，IL-18具有刺激Thl细胞分泌产生IFN-1及IL-2的功能，进而提高患者细胞免疫功能，因此可能具有增强DC治疗乙型肝炎疗效的作用，但目前仅为临床前期研究[20-21]，进一步相关机制及具体疗效尚需后期开展大规模临床试验来验证。

在慢性HBV感染患者，外周血pDCs数量没有变化，似乎不受HBV影响，但发现其功能包括分泌IFN-α的能力受损[22]。但也有研究发现，HBV携带者mDC和pDCs的频数和功能无论在体内还是体外均未改变。大多数学者认为，HBV不直接影响pDCs。我们的研究发现，与健康对照相比，在急性乙型肝炎患者pDCs的频数降低，且在治疗后第6周无明显变化。产生这种现象的原因可能为pDCs在慢性HBV感染患者被抑制，并没有发挥相应的作用，数量未出现明显改变。而在急性乙型肝炎患者外周血pDCs发挥重要作用，大量pDCs被招募到肝脏参与炎症反应，出现归巢现象[23]，导致外周血pDCs下降，且在治疗后一定时间内仍在肝脏聚集。pDCs表面的共刺激分子CD86与T细胞表面的CD28结合后可协同刺激T细胞活化，有助于HBV的清除[24]。相对于非活动HBsAg携带者，慢性HBV感染免疫耐受期患者pDCs表面CD86+表达显著下调[25]，间接说明HBV感染的慢性化的原因可能为pDCs功能受损导致。DC的免疫功能取决于其免疫状态，其表面CD83、CD86等免疫分子的表达水平低下或缺失将导致DC免疫功能低下或无免疫作用。乙型肝炎病毒及其蛋白可抑制pDC功能，经抗病毒治疗后，虽然DC细胞绝对数(CD86ABC)无显著变化，但具有刺激功能的CD86+pDC频数显著增加，表明pDC功能有所恢复[26]。本研究发现急性乙型肝炎患者发病初期pDCs表面CD86+的表达上调，且在治疗后仍持续高水平表达。而在治疗过程中CD86+pDCs的数量明显增加，提示CD86+pDCs可能在清除HBV过程中发挥重要作用。

总之，pDCs发挥有效的抗病毒作用是清除HBV的关键，而急性乙型肝炎与慢性乙型肝炎患者pDCs功能不同的原因，亦或说是pDCs的功能的不同决定了HBV感染的急性清除或慢性携带，其具体机制仍需进一步探讨。