榛花消肾安胶囊对糖尿病大鼠足细胞相关分子WT1、α3β1整合素表达的影响及与氧化应激的相关性

韩香莲 南征 朴松兰

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2长春中医药大学附属医院)

糖尿病肾病是一种发病率较高的糖尿病(DM)并发症，也是全世界造成终末期肾病的主要疾病之一〔1,2〕。近年来，我国糖尿病肾病患者数量呈递增趋势发展，现已成为影响国民健康的重大疾病之一〔3～5〕。在糖尿病肾病病变早期会出现肾小球足细胞数量下降，滤过膜逐渐被破坏，渗出大量蛋白尿，或因基底膜与壁上层之间发生粘连，进而形成肾小球阶段硬化灶〔6～8〕。榛花消肾安胶囊(ZHXSA)是依据“毒损肾络，邪伏膜原”的糖尿病肾病病机，采取“解毒通络、益肾达原”原则研制的方剂，在消渴病的治疗方面，能够获得良好的临床效果。本研究分析ZHXSA不同给药大鼠肾母细胞瘤抑制基因(WT1)、α3β1整合素表达与氧化应激相关指标的差异。

1 资料与方法

1.1实验材料 选取8周龄的健康Wistar雄性大鼠70只，体重180～220 g，购自大连医科大学动物中心〔合格证号：scxk(辽)2013-0003〕；主要实验试剂包括，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，强生稳豪血糖试纸、大鼠尿微量蛋白(ALB)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海希诺生物)；主要仪器包括，上海精密科学仪器FA1204B电子天平，意欧仪器仪表DT电子天平，强生稳豪血糖仪，美国伯乐imark酶标仪等。丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗大鼠WT1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)

1.2方法 大鼠适应性饲养1 w后，采用随机原则，将大鼠分为正常对照组(10只)与造模组(60只)；造模组以1%STZ(50 mg/kg)进行DM造模；72 h后采集大鼠尾静脉血，依照随机血糖≥16.7 mmol/L标准判断DM大鼠模型制备成功；将造模成功大鼠依照随机原则分成5组，其中3组分别予以ZHXSA 1.00 g/kg、0.50 g/kg、0.25 g/kg灌胃，分别为ZHXSA高、中、低剂量组，另1组每日予以厄贝沙坦片20 mg/kg灌胃(厄贝沙坦组)，剩余1组DM大鼠不做任何处理，作为DM模型组；大鼠均连续观察12 w后，腹主动脉取血，并在3 000 r/min、10 min条件下，获取血清，置于-20℃环境下保存；解剖大鼠，获取肾脏，经固定、石蜡包埋切片、苏木素-伊红(HE)染色、免疫组化等步骤；剩余肾脏组织检测mRNA。

1.3统计学分析 应用SPSS13.0统计软件行t检验。

2 结 果

2.1各组WT1比较 正常对照组在光镜中可见WT1沿着肾小球毛细血管按照线状均匀分布，而且在足细胞核中的表达比较明显。DM模型组WT1染色程度减弱，部分区域出现节段性缺失。ZHXSA高、中、低剂量组与厄贝沙坦组WT1表达略缺少，但与DM模型组比较有明显改善。见图1。

图1 大鼠肾脏WT1(免疫组化，×400)

DM模型组，ZHXSA高、中、低剂量组，厄贝沙坦组WT1灰度值均比正常对照组显著降低(P<0.01)；ZHXSA高、中、低剂量，厄贝沙坦组WT1灰度值均显著高于DM模型组(P<0.01)；ZHXSA高剂量组WT1灰度值显著高于低、中剂量组(P<0.05)；ZHXSA低、中剂量组WT1灰度值比较，组间差异无统计学意义(P>0.05)；ZHXSA高剂量组WT1灰度值显著高于厄贝沙组(P<0.05)。见表1。

2.2各组α3整合素表达差异 ZHXSA低、中、高剂量组，厄贝沙坦组，DM模型组α3整合素mRNA表达水平均显著低于正常对照组(P<0.01)；ZHXSA低剂量组α3整合素mRNA表达水平与中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)；ZHXSA高剂量组与厄贝沙坦组α3整合素mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；ZHXSA低、中、高剂量组，厄贝沙坦组α3整合素mRNA表达水平均显著高于DM模型组(P<0.05)；ZHXSA低、中剂量组α3整合素表达水平均显著低于厄贝沙坦组及ZHXSA高剂量组(P<0.05)。见表1。

2.3各组β1整合素表达差异 ZHXSA低、中、高剂量组，厄贝沙坦组，DM模型组β1整合素mRNA表达水平显著低于正常对照组(P<0.01)；与DM模型组比较，ZHXSA高、中、低剂量组，厄贝沙坦组β1整合素mRNA表达水平均显著提高(P<0.01)；ZHXSA低剂量组β1整合素mRNA表达水平显著低于中剂量组(P<0.05)；ZHXSA低、中剂量β1整合素mRNA表达水平均显著低于高剂量组及厄贝沙坦组(P<0.01)。见表1。

2.4各组MDA含量差异 ZHXSA低、中、高剂量组，厄贝沙坦组，DM模型组MDA含量均显著高于正常对照组(P<0.01)；ZHXSA中、高剂量组，厄贝沙坦组MDA含量均显著低于DM模型组(P<0.01)；ZHXSA低剂量组MDA含量水平显著高于中、高剂量组及厄贝沙坦组(P<0.05)。见表1。

2.5各组SOD水平差异 ZHXSA低、中、高剂量组、厄贝沙坦组，DM模型组SOD水平均显著低于正常对照组(P<0.01)；ZHXSA低、中、高剂量组，厄贝沙坦组SOD水平均显著高于DM模型组(P<0.01)；低、中剂量组SOD水平均显著低于厄贝沙坦组及高剂量组(P<0.01)。见表1。

2.6各组GSH-Px水平差异 ZHXSA低、中、高剂量组，厄贝沙坦组，DM模型组GSH-Px水平均低于正常对照组(P<0.01)；中药高剂量组及厄贝沙坦组GSH-Px水平显著高于DM模型组(P<0.01，P<0.05)。见表1。

表1 各组WT1、α3整合素、β1整合素表达及MDA、SOD、GSH-Px含量比较

与正常对照组比较：1)P<0.01；与DM模型组比较：2)P<0.01,3)P<0.05；与ZHXSA中剂量组比较：4)P<0.05；与ZHXSA低剂量组比较：5)P<0.05；与厄贝沙坦组比较：6)P<0.05

3 讨 论

糖尿病肾病早期病变为肾小球高滤过及微量尿蛋白，尤其是蛋白尿是比较典型的临床特征。目前，普遍认同糖尿病肾病与机体糖脂代谢紊乱、氧化应激反应等因素有关，在此过程中涉及多个信号传导通路及相应的细胞因子，在不同作用下引起糖尿病肾病〔9，10〕。虽然目前尚未完全确定糖尿病肾病发病机制，但发现足细胞损伤在病情发展过程中发挥了重要作用，这为糖尿病肾病的防控提供了新思路。

足细胞依附于肾小球基底膜外侧，属于肾小球滤过膜的一部分，是肾小球滤过功能中的关键环节〔11〕。其中，WT1能够体现成纤维细胞成长因子(FGF)-2引导的足细胞分化信号通路调解作用。α3β1整合素则属于跨膜异聚体的一种，有α、β亚单位共同组成，在足细胞依附于肾小球基底膜上过程中起到重要作用，若α3β1整合素表达异常，则黏附作用随之下降，造成足细胞脱落，进而可能造成肾小球滤过功能削弱，产生蛋白尿〔12〕。有研究发现，氧化应激反应能够对肾小球的足细胞增殖作用产生一定的影响，进而使其黏附作用受损〔13〕。而体内处于高血糖状态，则可通过多种途径在肾小球足细胞内形成活性氧簇，线粒体功能发出现障碍，介导足细胞进入凋亡进程，而足细胞也因此发生收缩、足突融合情况〔14〕。GSH-Px、SOD、MDA均在氧化应激反应过程中发挥重要作用〔15〕。而采取积极有效措施，能够减少组细胞损伤程度，改善DM患者肾脏功能。

糖尿病肾病在祖国医学中可归属于“肾消”及“水肿”等疾病范畴内，因体内脂膏堆积，另有痰、瘀、湿、热等邪气袭体日久，相互作用，形成毒邪，伏于膜原，肾络受损，久则体用损伤，随之肾间动气伤甚，形成消渴肾病。但因膜原非药石所及，故病情缠绵难愈。

本研究结果表明，ZHXSA组在降低MDA含量、提升SOD、GSH-Px水平，强化WT1、α3β1整合素mRNA的表达方面效用明显。不仅如此，ZHXSA在提升WT1灰度值方面，表现出量效关系，在提高α3β1整合素 mRNA含量上看，表现出对浓度的一定程度依赖性。同时，从氧化应激指标上看，ZHXSA能够降低MDA水平，提高SOD、GSH-Px含量，说明本药具有抗氧化应激的作用。

总之，ZHXSA能够对抗氧化应激反应，提高足细胞WT1及α3β1整合素水平，发挥肾脏保护作用。