急性鼻窦炎和扁桃体炎中病原体特异性浆细胞及其迁移潜能

白雪峰 何信众

(桐乡市第一人民医院耳鼻喉科，浙江 桐乡 314500)

人类上呼吸道反复暴露于多种吸入的微生物，因此，上呼吸道感染是初级卫生保健急诊室就诊的最常见原因〔1,2〕。上呼吸道病原体中高感染率，流感流行和抗生素耐药性增加，都表明需要更有效的疫苗接种策略来保护这一门户〔3〕。黏膜抗体在上呼吸道的黏膜防御中发挥关键作用，因为其是干扰感染的初始步骤，可防止病原体的附着〔4～6〕。特异性抗体分泌细胞(ASCs)的传播具有组织选择性，其中归巢受体(HR)和趋化因子受体起中心作用〔7，8〕。尚不完全了解哪些HR将细胞引导至呼吸道，并且在该位点引起的反应的靶向仍未在人类中进行充分研究。因此本文对急性鼻窦炎和扁桃体炎中病原体特异性浆细胞及其迁移潜能进行研究。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年12月至2018年12月的260例门诊患者，其中急性扁桃体炎130例(扁桃体炎组)，急性鼻窦炎130例(鼻窦炎组)。急性扁桃体炎诊断〔9〕基于典型病史，包括发烧，喉咙痛，前颈椎病等。急性鼻窦炎诊断典型病史包括鼻充血，脓性鼻涕，面部疼痛或压力，嗅觉受损等，并且上颌灌溉细菌脓性分泌物≥105cfu/ml，患者细菌培养阳性，且症状持续时间少于2 w。选取90例在医院体检的健康志愿者为健康组。3组一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。排除标准〔10〕：①肝功能或肾功能异常；②严重高血压；③器质性心脏病；④糖尿病；⑤恶性肿瘤；⑥免疫功能低下；⑦先天性疾病。患者均获得书面知情同意书，研究方案和数据管理得到地区卫生服务人类研究伦理委员会的批准。

表1 3组一般情况比较

1.2实验设计 第1次就诊期间，由耳科医生进行上颌灌洗(鼻窦炎组)并采集咽拭子(扁桃体炎组)，根据主治医院的微生物实验室的程序分离病原体。将每种分离物悬浮在0.9%盐水溶液中，加入浓度为2%的甲醛，将浓度调节至108细菌/ml磷酸盐缓冲液(PBS)。在急性鼻窦炎或扁桃体炎患者中寻找病原体特异性循环ASCs。使用酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法分析病原体特异性ASCs及其同种型分布，并通过免疫磁性细胞分选和ELISPOT组合检测整合素α4β7和L-选择素的表达。

1.3观察指标 进行总外周血单个核细胞(PBMC)群体、受体阳性和阴性亚群中病原体特异性ASC分析和IgA，IgG和IgM的ELISPOT分析。为评估病原体特异性ASC，致病菌株的悬浮液使用96孔微量滴定板。在IgA、IgG和IgM的ELISPOT分析中使用人IgA，IgM或IgG特异性抗血清(在PBS中稀释)。洗涤并掩蔽孔后，加入总PBMC群的等分试样或受体阳性和阴性亚群。用碱性磷酸酶耦联的抗人IgA，IgG或IgM检测细胞分泌的抗体/免疫球蛋白，接着用熔化的琼脂糖中的底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)检测。

1.4苏木素-伊红(HE)染色 通过HE法观察急病原体特异性浆细胞。将样本置于包埋盒中冲洗30 min后用一定浓度梯度的酒精进行脱水处理，然后用石蜡包埋，切成5 μm厚度大小，烘干后进行HE染色。使用明视场显微镜和扫描共聚焦激光显微镜检查所有样品并拍照。

1.5细胞活力测定 在96孔板中培养病原体特异性浆细胞，以1/10稀释度向每个孔中加入10 μl CCK-8溶液，在培养箱中孵育2 h。酶标仪在450 nm处测量吸光度。根据的平均光密度(OD)计算细胞活力的百分比：细胞活力的百分比= OD处理组/OD对照组×100%。实验重复3次。

1.6迁移相关蛋白免疫印迹分析 静脉抽取血液样本，离心稀释，将离心样本放置于100 μl缓冲液中，通过BCA蛋白质测定试剂盒测定全细胞提取物的含量。加入10 μg样品并在10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。转移后硝酸纤维素膜在4℃下用5%牛血清白蛋白封闭过夜处理，用指示的抗体探测。使用适当的免疫球蛋白试剂通过增强化学发光观察印迹。

1.7整合素α4β7、皮肤相关抗原(CLA)及L-选择素检测方法 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集外周血2 ml，摇匀后置入4℃冰箱内保存，24 h内用流式细胞仪检测整合素α4β7、L-选择素和CLA。采用直接法检测整合素α4β7及L-选择素。整合素α4β7异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠多克隆抗体和L-选择素标记的鼠抗人单克隆抗体分别购自Santa Cruz Biotechnology 公司、eBioscience公司。流式细胞仪(美国库尔特公司EPITS′ XL)设定激发光波长为488 nm，发射光波长为526 nm，利用EPITS′ XL配套软件进行数据分析。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1鼻窦炎组和扁桃体炎组病原体分析 鼻窦炎组病原体主要为肺炎杆菌〔60例(46.15%)〕和流感病毒〔60例(46.15%)〕，10例为咽峡炎链球菌感染。扁桃体炎组病原体主要为化脓性链球菌〔110例(84.62%)〕，20例为β-溶血性链球菌感染。鼻窦炎感染有70例(53.85%)体温超过38℃，扁桃体炎组有90例(69.23%)体温超过38℃。

2.2病原体特异性浆细胞染色 与健康组相比，鼻窦炎组和扁桃体炎组中病原体特异性浆细胞含量较高，染色颜色也较深，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2。

图1 病原体特异性浆细胞染色(×100)

2.3细胞活力检测 与健康组相比，鼻窦炎组和扁桃体炎组中细胞活力显著较高(P<0.05)。见表2。

表2 细胞数目、染色强度及CCK-8检测细胞活力

与健康组比较：1)P<0.05；下表同

2.4迁移相关蛋白免疫印迹分析 鼻窦炎组和扁桃体炎组与健康组相比基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表达均明显增加(P<0.05)。见图2，表3。

图2 迁移相关蛋白免疫印迹

表3 迁移相关蛋白的表达量

2.5整合素α4β7、L-选择素和CLA 与健康组相比，鼻窦炎组和扁桃体炎组整合素α4β7、L-选择素和CLA表达均明显增加(P<0.05)。见表4。

表4 整合素α4β7，L-选择素和CLA在病原体特异性ASCs上表达

3 讨 论

IgG证实是鼻窦炎和扁桃体炎中最常见的Ig同种型。符合以前对于上呼吸道疫苗接种的研究：扁桃体霍乱免疫和鼻内流感疫苗接种已被证明在循环和扁桃体和腺样体中诱导IgG主导的浆母细胞反应〔11〕。IgG同种型在肺炎的浆细胞反应中也占主导地位。据报道，在腺样体中存在具有丰富的聚合IgA，J链和多聚免疫球蛋白受体(pIgR)/SC特异性上皮成分的黏膜分泌系统，但在扁桃体中没有〔12,13〕。因此，鼻窦炎患者的IgA-ASC反应频率高于扁桃体炎可能反映了该疾病中腺样体中更明显的B细胞引发〔14,15〕。

在急性鼻窦炎和扁桃体炎研究中，病原体特异性浆母细胞的整体归巢概况相似：大多数细胞表达L-选择素，并且小于四分之一整合素α4β7或CLA。这种相似性表明参与相同的激活位点。数据揭示了在上呼吸道引发的浆母细胞的独特归巢特征：该特征不仅与腹泻(整合素α4β7高，L-选择素低，CLA可忽略不计)或上尿路感染(α4β7中/高，L-选择素中/高和CLA低)特征相似，也用于下呼吸道感染(整合素α4β7中，L-选择素高，CLA低)〔16,17〕。该特征似乎与通过肠胃外疫苗接种引起的全身性免疫应答类型(整合素α4β7低，L-选择素高，CLA 低)最相似〔18〕。

据报道，高水平的MMP-2和MMP-9可增加内皮细胞的迁移〔3，19〕。在本研究中，MMP-2和MMP-9表达升高，从而影响急性鼻窦炎和扁桃体炎中病原体特异性浆细胞的迁移能力。从中可知，急性鼻窦炎和扁桃体炎中病原体特异性浆细胞表达较高，细胞活力增加，迁移相关蛋白表达较高。证明急性细菌性上呼吸道感染在循环中诱导病原体特异性浆母细胞，IgG浆母细胞是主要的同种型。对于上呼吸道，显示出具有高比例的L-选择素和不足的整合素α4β7和CLA的特征性归巢谱。

综上所述，急性鼻窦炎和扁桃体炎中病原体特异性浆细胞表达较高，细胞活力增加，迁移相关蛋白表达较高。