SD大鼠心脏结构和功能增龄性改变及与炎症因子表达的相关性

刘海娘 付浩燃 于勤

(1大连大学,辽宁 大连 116001；2大连大学附属中山医院循环三科)

自然衰老与心血管疾病的发生、发展有密切联系。临床研究显示增龄本身是心脏结构改变、功能减退的独立危险因素〔1〕。心力衰竭(简称心衰)是近年来临床常见的心血管疾病，主要的病理改变是心肌细胞的肥大和间质的纤维化，临床表现为心脏功能不全〔2,3〕。流行病学资料显示〔4,5〕，心衰主要发生于高血压、心脏结构和功能异常的老年患者，且随着年龄的增加，心衰的发病人数在不断增加。心血管疾病，尤其是心衰初始的发生发展往往和心肌炎密切相关，炎症因子的大量表达会加剧心脏结构的病理改变〔6～8〕。目前，关于心脏结构和功能随着年龄的增加如何改变，其改变与炎症因子表达的关系如何未见相关报道。本研究将探究SD大鼠随着月龄的增加，其心脏结构和功能的改变，同时分析其与炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的相关性。

1 材料与方法

1.1试剂材料 TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国博士德生物工程有限公司，兔抗鼠多克隆TNF-α抗体购自中国万类科技生物有限公司和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自中国碧云天生物技术研究所，Masson试剂购自安特捷生物有限公司。

1.2动物及分组 清洁级雄性SD大鼠，体重350～550 g，购于大连医科大学实验动物中心，适应性喂养2 w，予正常饮食饮水。30只大鼠根据月龄分为3 组：6月龄组、18月龄组和26月龄组，每组10只。整个实验方案经过大连大学伦理委员会讨论通过。

1.3超声心动图测定心脏大小和心功能 采用10%水合氯醛按3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠麻醉生效后，以5%硫化钠进行脱毛处理，取仰卧位，采用GE Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，12.0 MHz的高频探头，行心功能参数测量。选择M型超声经胸骨左缘左室长轴切面测量左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)，同时仪器系统自动计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)值。其中LVFS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%，LVEF则按照Teichholz公式〔9〕。采用彩色多普勒超声于心尖四腔切面取二尖瓣口正向血流频谱，测量二尖瓣舒张早期血流速度峰值(E)和二尖瓣舒张晚期血流速度峰值(A)；组织多普勒超声于心尖四腔切面取二尖瓣环频谱，测量二尖瓣环舒张早期运动速度峰值(E′)，并计算E/A和E/E′。上述心脏超声参数的获取均由专业的超声医生完成操作，每只大鼠测量3个心动周期，取平均值。

1.4血清TNF-α的测定 超声完成后，从大鼠的腹主动脉抽出血液约2 ml放入4℃冰箱中静置过夜，3 000 r/min 离心10 min 分离血清，吸取上清液保存于EP管。根据ELISA试剂盒说明书测定各组大鼠血清中TNF-α含量。

1.5免疫组化测定心肌组织中TNF-α含量 处死大鼠后开胸取出心脏，取左室心肌组织行常规石蜡包埋和组织切片，片厚4 μm，行免疫组化检测心肌组织TNF-α的表达。显微镜下观察免疫组化染色切片，TNF-α阳性表达显示为棕黄色。左室心肌组织TNF-α含量的评价：每组动物取5张切片，每张切片取5个高倍视野，用Image Pro-Plus6.0图像分析软件分析，计算出TNF-α阳性表达百分比，即棕黄色阳性表达面积占整个心肌组织面积的百分比，取测量的平均值比较。

1.6Masson 染色检测胶原的含量 同1.5中组织切片后，行Masson 三色染色法观察心肌纤维化的程度。显微镜下观察Masson 染色切片，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。左室心肌间质纤维沉积的评价：每组动物取5张切片，每张切片取5个高倍视野，用Image Pro-Plus6.0图像分析软件分析，计算出胶原容积分数(CVF)，即胶原纤维面积占整个心肌组织面积的百分比，取测量的平均值比较。

1.7心肌超微结构的观察 麻醉后立即开胸取出心脏，迅速取左心室前壁心肌，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 的小块状，立即浸入2.5 %的戊二醛复方固定液中，标本送检于大连医科大学电镜实验中心，使用透射电子显微镜(JEM-2000EX,JEOL,Japan)观察不同组别心肌组织的超微结构。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析，同时采用双变量Pearson分析进行相关性分析。

2 结 果

2.1心脏结构 与6月龄大鼠比较，18月龄和26月龄大鼠LVESD、LVEDD逐渐增大，IVSD逐渐增厚，8月龄LVEDD、IVSD与6月龄组比较差异有统计学意义(P<0.05)，26月龄LVEDSD、LVEDD、IVSD与6月龄大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05)，26月龄LVEDD与18月龄比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着年龄的增加LVEF、LVFS逐渐降低，与6月龄和18月龄大鼠相比，26月龄大鼠LVEF、LVFS显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表1和图1。

表1 不同月龄大鼠M型超声参数变化

与6月龄组比较:1)P<0.05;与18月龄组比较:2)P<0.05，下表同

图1 不同月龄大鼠心脏结构变化 M型超声

2.2心脏功能 与6月龄大鼠比较，18月龄和26月龄大鼠心脏舒张功能逐渐变差，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同月龄大鼠心脏多普勒参数变化

2.3左室心肌组织Masson染色 6月龄大鼠心肌组织基本无胶原增生，其心肌组织CVF为(1.39±0.19)%；18月龄大鼠心肌组织中胶原纤维与6月龄组比较明显增生(P<0.05)，其心肌组织CVF为(3.03±0.63)%；26月龄大鼠〔心肌组织CVF为(7.92±0.47)%〕与18月龄及6月龄相比心肌组织中胶原纤维均有显著增生，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 不同月龄大鼠左室心肌组织(Masson染色，×200)

2.4各组大鼠左室心肌组织超微结构 6月龄大鼠的心肌细胞结构清晰，肌原纤维排列整齐，肌节完整，Z 线结构清晰，线粒体嵴结构清晰；18月龄大鼠心肌细胞略有肿胀，肌原纤维结构排列基本整齐，Z线结构较清晰，线粒体略有增生，嵴较清晰，心肌细胞间可见胶原纤维轻度增生；26月龄大鼠心肌细胞肿胀，肌原纤维结构松散，部分肌原纤维断裂、溶解，排列紊乱，部分Z线消失，线粒体嵴减少，结构不清晰，心肌细胞间可见大量胶原纤维。见图3。

图3 不同月龄大鼠左室心肌组织超微结构(× 1 500)

2.5各组大鼠心肌组织和血清中TNF-α含量 6月龄大鼠心肌组织和血清中TNF-α表达最少，18月龄大鼠心肌组织和血清中TNF-α含量与6月龄大鼠组比较明显增加(P<0.05)，26月龄大鼠与18月龄及6月龄大鼠相比，心肌组织中和血清中TNF-α水平均有显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4，表3。

图4 各组大鼠左室心肌组织中TNF-α的表达(DAB，×200)

表3 不同月龄大鼠心肌组织和血清TNF-α含量比较

2.6各组大鼠心功能参数及心肌组织和血清中TNF-α含量的相关性 各组大鼠心功能参数IVSD、LVESD、LVEDD、E/E′和CVF%与心肌组织及血清中TNF-α显著正相关(P<0.05)，LVEF、LVFS、E/A与TNF-α水平显著负相关(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠心功能参数与TNF-α的相关性

3 讨 论

超声心动图与心脏磁共振(CMR)、心脏核素显像等技术相比具有无创、简便、重复性好等优势，在临床上被广泛用于心脏形态、结构和功能的评价。M型心脏超声、二尖瓣血流频谱和组织多普勒在心脏评估中最为常用〔10,11〕。年龄是影响心脏结构和功能的重要因素。本实验结果表明，随着大鼠月龄的增加，心脏结构和功能逐渐变差。

同时，本研究还从病理学检测考察了增龄性对心脏病理改变的影响。有研究表明，患者在早期心脏舒张功能有轻度减退，中期心肌细胞凋亡或死亡,心脏舒张功能异常或轻度收缩功能异常，晚期则会有微血管病变,心脏舒张功能、收缩功能异常〔12〕。随着大鼠月龄的增加，本研究脉冲多普勒发现心脏减速时间延长,提示心脏舒张功能减退。此时，心脏心肌组织伴随明显的病理改变，最显著的就是心肌纤维化。本研究结果说明，增龄性带来的心脏病理改变是随着月龄的增加，心肌间质会有大量胶原纤维沉积，尤其是老年化大鼠最为显著。胶原纤维在心肌细胞间质大量沉积进而导致心肌顺应性下降,舒张功能减退。增龄性伴随的心肌细胞挛缩、肌原纤维收缩带形成,细胞水肿,线粒体变性外逸,融合、漂浮,结构不清,心肌细胞内多处出现脂褐素等老化现象，提示心肌退行性变加重，因而心脏结构异常，功能减退。

研究表明〔13～15〕，促炎细胞因子TNF-α、IL-6等均能直接影响心肌收缩功能，并导致心衰。本研究提示随着SD大鼠的老年化，心脏组织中存在过度的炎症反应及免疫功能紊乱，最终可能引发心肌纤维化，心力衰竭，从而导致死亡。

综上所述，SD大鼠随着老年化会出现心脏结构异常和心脏功能减退的现象，同时伴随明显的心肌细胞的病理改变。老龄性心脏结构及功能的异常与炎症因子的表达水平存在相关性。