miR-23b-3p靶向PALM3对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子表达的影响

戴彩同，张少锋，黄玉洁

(1.广东省惠州市第六人民医院 呼吸内分泌科,广东 惠州516200；2.广东医科大学附属医院 呼吸科,广东 湛江524000)

肺泡上皮由Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞组成，Ⅱ型肺泡上皮细胞的更新能力有助于维持肺泡的完整，参与肺免疫和炎症反应[1]。肺炎链球菌是肺炎的最主要病原菌，导致肺泡上皮细胞凋亡和产生炎症，针对其凋亡和炎症的机制探讨可助于预防和治疗肺炎。

研究表明，PALM3在脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤模型中肺组织内的表达增加，干扰PALM3 表达能减轻LPS诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞炎症反应[2]。而本研究通过生物信息学预测发现，paralemmin-3(PALM3)可能是miR-23b-3p的靶基因。miR-23b-3p对冠状动脉内皮细胞[3]和H2O2诱导的血管内皮细胞HUVECs[4]起保护作用。但miR-23b-3p在肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中的表达及作用还尚未可知。

本研究通过建立A549细胞的肺炎链球菌模型，研究miR-23b-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞炎症和凋亡的影响，并探讨PALM3在此机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

肺泡上皮细胞A549和肺炎链球菌株ATCC BAA-255购自美国ATCC；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶和肝素购自Sigma-Aldrich公司；引物、miR-23b-3p 模拟物(miR-23b-3p)、抑制剂(anti-miR-23b-3p)、PALM3过表达载体(pcDNA-PALM3)、PALM3抑制剂(si-PALM3)、空载体和对照物(pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及PALM3突变型和野生型双荧光素酶载体购自苏州吉玛基因；Total RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)、real-time PCR 试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；PALM3抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体和GAPDH抗体购自英国Abcam公司；白介素-6(interleukin 6，IL-6)和白介素-10(interleukin 10，IL-10)ELISA检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；流式细胞仪购自美国BD公司，全自动酶标仪和Real-time PCR仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1细胞和肺炎链球菌培养[5]

将A549细胞培养在含有10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 ℃ 5% CO2恒温密闭培养箱中培养，消化传代。

肺炎链球菌培养于含5%脱纤维羊血的血平板中，将实验开始前于托休二氏溶液(含0.5%酵母)中培养过夜。

1.2.2细胞处理和实验分组[5]

将A549细胞分为对照组、感染组、转染组和感染组+转染组。对照组：用RPMI-1640K培养基正常培养；感染组：将A549培养至融合度达到90%左右时，然后用1×108CFU/mL的肺炎链球菌培养A549细胞；转染组：将不同载体或对照转染A549细胞48 h；感染组+转染组：细胞先进行转染48 h，然后用1×108CFU/mL的肺炎链球菌培养转染的A549细胞。

1.2.3细胞转染和RNA提取

当A549细胞培养至融合度为80%时，根据转染试剂盒说明书进行进转染。转染分组：miR-23b-3p过表达组：转染miR-NC和miR-23b-3p；miR-23b-3p抑制组：转染anti-miR-NC和anti-miR-23b-3p；PALM3抑制组：转染si-NC和si-PALM3；miR-23b-3p和PALM3双过表达组：转染miR-23b-3p+pcDNA和miR-23b-3p+pcDNA-PALM3；PALM3野生型和突变型的双荧光素酶报告系统组：分别转染WT-PALM3+miR-NC，WT-PALM3+miR-23b-3p，MUT-PALM3+miR-NC和MUT-PALM3+miR-23b-3p。将上述载体或片段转染培养好的A549细胞，转染48 h后收集细胞。

收集转染过和/或肺炎链球菌感染的A549细胞，提取细胞总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，再以cDNA为模板根据 Real-time PCR试剂盒的说明书合成PALM3 mRNA和miR-23b-3p；反应程序为：94℃5 min；94℃40 s、59℃30 s、72℃42 s，40个循环；72℃10 min。用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.4流式细胞术测定细胞凋亡率

收集各组转染或/和感染的A549细胞并将细胞稀释为1×105个/mL，取100 μl 1×Binding buffer重悬细胞，然后根据凋亡试剂盒说明书，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，室温避光20 min，再加入400 μl 1×Binding buffer，上流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.5检测细胞中IL-6和IL-10的含量

收集各组A549细胞的培养上清，按照IL-6和IL-10试剂盒说明书操作，检测细胞培养上清中IL-6和IL-10的含量。

1.2.6双荧光素酶报告系统实验

按照1.2.3的步骤进行A549细胞培养和转染。将构建好的含有miR-23b-3p与PALM3预测结合位点的野生型(WT-PALM3)和突变型(MUT-PALM3)双荧光素酶报告载体，分别与miR-NC或miR-23b-3p共转染A549细胞。转染48h，收集并裂解细胞，离心收集上清，根据双荧光素酶报告系统试剂盒说明书进行操作，以海肾荧光素酶活性为内参照，检测相对萤火虫荧光素酶活性。

1.2.7Western blot检测PALM3和凋亡相关蛋白

收集A549细胞，裂解细胞并超声破碎，收集蛋白，每个蛋白样本进行SDS-PAGE分离蛋白条带，转PVDF膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗(PALM3抗体 1:2000，Bcl-2抗体 1∶4000，Bax抗体 1∶3000，GAPDH抗体1∶5000)，4℃孵育过夜，洗膜2次，加入稀释的酶标二抗，室温孵育2 h，显影，以GAPDH为内参照，分析蛋白百度水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-23b-3p和PALM3在肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞A549中的表达

与对照组相比，肺炎链球菌感染组肺泡上皮细胞A549中miR-23b-3p含量明显降低(P<0.05)，PALM3的mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05)，见图1和表1。

图1 PALM3蛋白表达

表1 miR-23b-3p和PALM3在肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中的表达

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 miR-23b-3p过表达对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症因子表达的影响

与对照组相比，感染组A549中细胞凋亡率升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表达升高(P<0.05)，上清液中IL-6增多且IL-10减少，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与感染组+miR-NC组相比，感染组+miR-23b-3p组A549细胞中miR-23b-3p含量显著升高，细胞凋亡率降低，IL-10和Bcl-2蛋白水平升高，IL-6和Bax水平降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图2和表2。说明肺炎链球菌可诱导A549细胞凋亡和炎症反应；过表达miR-23b-3p可抑制肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症。

图2 miR-23b-3p过表达对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡的影响

表2 miR-23b-3p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与感染组+miR-NC组比较，#P<0.05

2.3 干扰PALM3表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

与感染组+si-NC组相比，感染组+si-PALM3组A549细胞中PALM3含量显著降低，细胞凋亡率降低，IL-10和Bcl-2蛋白水平升高，IL-6和Bax蛋白水平降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图3和表3。说明干扰PALM3表达可抑制肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症。

图3 干扰PALM3表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡的影响

表3 干扰PALM3表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与感染组+si-NC组比较，#P<0.05

2.4 miR-23b-3p靶向调控PALM3的表达

通过TargetScan预测发现，PALM3的3’UTR中含有与miR-23b-3p互补的序列，见图4A。双荧光素酶报告系统结果如表4所示，过表达miR-23b-3p可使野生型WT-PALM3的萤火虫荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)；而突变型MUT-PALM3的荧光素酶相对活性无明显变化。Western blot实验结果表明，过表达miR-23b-3p可下调PALM3表达量；抑制miR-23b-3p表达则上调PALM3表达量，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图4B和表5。说明miR-23b-3p靶向负调控PALM3的表达。

图4 miR-23b-3p靶向调控PALM3的表达

表4 双荧光素酶报告实验

注：与miR-NC组比较，*P<0.05

表5 miR-23b-3p调控PALM3的表达

注：与miR-NC组比较，*P<0.05；与anti-miR-NC组比较，#P<0.05

2.5 PALM3过表达逆转了miR-23b-3p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的作用

为确认miR-23b-3p是否通过PALM3影响肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症，过表达miR-23b-3p的同时过表达PALM3表达。结果表明，与结果2.2一致，过表达miR-23b-3p可抑制肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症；与感染组+miR-23b-3p+pcDNA组比较，感染组+miR-23b-3p+pcDNA-PALM3组A549细胞中PALM3表达升高，细胞凋亡率升高，IL-10和Bcl-2的水平降低，IL-6和Bax蛋白水平升高，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，见图5和表6。说明过表达PALM3逆转了过表达miR-23b-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症的作用。

图5 PALM3过表达逆转了miR-23b-3p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡的作用

3 讨论

研究表明，Paralemmin-3(PALM3) 在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(acute lung injury，ALI)组织中表达上调，而干扰PALM3表达可降低小鼠肺损伤死亡率，鼻内应用特异性siRNA抑制PALM3对LPS诱导的ALI具有保护作用[6]。ALI大鼠模型中，下调palm3可提高生存率，减轻肺组织病理改变，减轻肺水肿、肺血管渗漏和中性粒细胞浸润，抑制促炎性细胞因子的产生，抑制核因子κB和干扰素β调节因子3的活化，促进大鼠肺泡灌洗液分泌[7]。在LPS刺激后，PALM3可以与肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)中的Toll样受体4(TLR4)、髓细胞分化因子88、白细胞介素(IL)-1受体相关激酶-1、肿瘤坏死因子受体相关因子-6、以及含有适配器分子-2的Toll-IL-1受体相互作用，促进AMs中LPS诱导的炎症反应，并参与了LPS-TLR4信号的传递[8]。以上研究结果均说明，PALM3在肺损伤中表达上调，促进炎症反应。本研究通过肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞A549，结果表明，感染组PALM3的mRNA和蛋白水平明显升高，IL-6、Bax水平及细胞凋亡率明显升高，IL-10、Bcl-2含量明显降低，干扰PALM3表达可抑制肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症，与上述结果一致[6,7]，PALM3参与肺炎的发生。

表6 PALM3过表达逆转了miR-23b-3p过表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的作用

注：与感染组+miR-NC组比较，*P<0.05；与感染组+miR-23b-3p+pcDNA组比较，#P<0.05

此外，本研究通过TargetScan预测发现，PALM3的3’UTR中含有与miR-23b-3p互补的位点，提示PALM3可能是miR-23b-3p的靶基因，miR-23b-3p可能靶向PALM3参与对肺炎链球菌诱导的A549凋亡和炎症的调控过程。研究表明，miR-23b-3p在肝癌[9]、食管鳞状细胞癌[10]和胃癌[11]中表达异常，与癌症的恶性进展、癌细胞的增殖和转移或化疗抗药性有关。miR-23b-3p在非小细胞肺癌患者中的表达显著增加，与患者总体低生存率相关[12,13]。miR-23b-3p在肺炎中的研究较少。本研究结果发现，miR-23b-3p在肺炎链球菌诱导的A549中水平显著降低，过表达miR-23b-3p表达可减轻肺炎链球菌诱导的A549细胞炎症并抑制细胞凋亡，说明miR-23b-3p在肺炎链球菌诱导的A549细胞炎症中发挥保护作用。

本研究通过双荧光素酶报告系统和Western blot结果发现，miR-23b-3p靶向负调控PALM3的表达；过表达PALM3逆转了过表达miR-23b-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症的作用，验证了在肺炎链球菌诱导的A549中miR-23b-3p靶向调控PALM3发挥作用。

综上所述，在肺炎链球菌诱导的A549中，miR-23b-3p表达下调，PALM3表达上调，肺炎链球菌可能通过下调miR-23b-3p靶向PALM3诱导A549细胞的炎症发生和促进细胞凋亡。miR-23b-3p和PALM3可能是肺炎链球菌所致肺炎的潜在靶点。