β-二氢青蒿素-大黄素复合物对人胃癌细胞株SGC-7901作用的实验研究

辛 悦，杨万山，金光洙，赵俊军，孙 抒*

(1.大连市中心医院 病理科，辽宁 大连116000；2.延边大学医学院 病理学与法医学教研室，延吉133002；3.延边大学药学院药物化学教研室，延吉133002)

胃癌(gastric carcinoma，GC),全球第四大常见癌症之一，其发病率占消化道肿瘤之首，多数发现的临床患者都已达到中晚期，这就面临着单纯手术疗效差，辅以放、化疗毒副作用大的问题[1-3]。为了减轻患者的痛苦，提高其生活质量，我们将视线转投到从天然药用资源中寻找高效低毒的化合物作为新一代的化疗药物的开发上。近些年的研究发现二氢青蒿素具有一定的抗肿瘤作用[4]。二氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素衍生物中主要的活性代谢体。分子式为C15H24O5，分子量为284，具有良好的吸收性。另外一种颇为受瞩目的抗肿瘤中药为大黄素，它是中医治疗肿瘤方剂中最常用的药物之一。大黄素(emodin)，化学名为l,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthra-quinone)属蒽醌类衍生物,是从植物Polygonum Cuspidatum中提取的，具有广泛的药理作用，既往的文献指出，大黄素对肺癌[5]、宫颈癌[6]、乳腺癌[7]、结肠癌[8]、胃癌[9]、肝癌[10]等多种肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用。本实验使用的复合物是二氢青蒿素和大黄素通过酯键结合形成的的新型抗肿瘤候选化合物-β-二氢青蒿素-大黄素复合物。目前，β-二氢青蒿素-大黄素复合物抗肿瘤作用尚未见报道。本实验选取人胃癌SGC-7901细胞株为实验细胞，旨在研究β-二氢青蒿素-大黄素复合物能否诱导人胃癌SGC-7901细胞发生凋亡并探讨其机制，为β-二氢青蒿素-大黄素复合物具有抗肿瘤作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与药物

人胃癌细胞SGC-7901购买于北京华美生科生物技术有限公司，由本实验室体外培养、传代。β-二氢青蒿素-大黄素复合物由延边大学药学院金光洙博士合成提供，先用吐温80和0.3%的纤维素钠溶解，并将其混匀，于-4℃保存备用。再根据需要，用PBS稀释成实验所需浓度。

1.2 主要试剂及仪器

MTT(Biomol公司)；苏木素染液(Solarbio公司)；单克隆抗体(CyclinD1，Ki-67)、Annexin-V/PI试剂盒、(美国Becton Dikinson公司)；Hoechst33258荧光染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；十二烷基硫酸钠(SDS)，N,N-亚甲双丙烯酰胺，TEMED，丙烯酰胺，过硫酸铵(APS)，β-巯基乙醇，β-actin(美国sigma公司)；光学显微镜、荧光显微镜(日本OLYMPUS)；流式细胞仪(美国BD公司)；SDS-PAGE电泳仪(Bio-red美国公司)；全波长酶联免疫检测仪(TECAN公司产品，型号infiniteM200PRO)。

1.3 方法

1.3.1MTT比色法

按照MTT的实验原则，将浓度为6×104个/ml的胃癌SGC-7901细胞悬液接种于96孔培养板中，实验孔每孔加入180 μl的细胞悬液后，放入培养箱过夜。次日观察贴壁后，每个实验孔加入20 μl的药物，药物终浓度分别为2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml，而对照组每孔则加入20 μl的药物溶剂作为阴性对照。分别培养24 h、48 h、72 h后，加入20 μl的 MTT溶液(其浓度为5 mg/ml)，培养4 h后，取出，避光，每孔加入150 μl的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，放在震荡仪上振荡，最后酶联免疫检测仪检测在波长为492 nm处的吸光度(Optical density，OD)值。

为了保证实验的准确性，重复实验3次。利用公式计算出细胞的增殖抑制率。计算公式如下：肿瘤细胞增殖抑制率(%)=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.2HE染色

将人胃癌SGC-7901细胞制成浓度为6×104个/ml的细胞悬液爬片培养。次日确定细胞生长状态良好进行试验。设定分别加入终浓度为2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氢青蒿素-大黄素复合物的为实验组，加等量药物溶剂的为对照组，培养48 h后，取出盖玻片，用95%乙醇室温固定30 min。冲洗后，苏木素染色3-5 min，1%盐酸酒精分化1-3 s后，温水返蓝，伊红染液30 s，梯度酒精脱水各1-2 min，之后二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照记录。

1.3.3Hoechst33258染色

人胃癌SGC-7901细胞进行爬片，确定爬片且细胞状态良好则进行实验。分别加入终浓度为2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氢青蒿素-大黄素复合物作为实验组，加入等量的药物溶剂作为对照组，放入培养箱内培养48 h。48 h后准备固定和染色。用PBS洗涤后，各孔均加入0.5 ml的固定液，4℃过夜；次日洗涤后，加入0.5 ml的Hoechst33258染色液，避光染色5 min；去染色液，滴抗荧光淬灭封片液封片。荧光显微镜下可检测到蓝色的细胞核，激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右，拍照记录。

1.3.4Annexin V/PI双染

用冷PBS分别洗涤实验组和对照组细胞2次，1 000 rpm，5 min；之后，加入500 μl的1×Binding Buffer，轻轻吹打使其均匀，再将100 μl的溶液转移到5 μl的培养管中，加入5 μl的FITC Annexin V染色工作液和10 μl的PI染色工作液，轻轻涡旋细胞，并在室温、避光的条件下孵育15 min；最后，每个管中加入400 μl的1×Binding Buffer，严格避光条件下1 h内完成上机检测，以免影响结果。

1.3.5免疫印迹法(Western Blotting)

将处于对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞吹打制成浓度为6×104个/ml的细胞悬液，设定实验组和对照组，放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48 h后，用150-200 μl的工作液进行细胞裂解，并小心收集实验所需蛋白。参照碧云天生物技术有限公司BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)说明进行BCA工作液配制。并用酶标仪测定A562处的各孔吸光度，测得的每个待测样品孔和标准孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值，以校正过的BSA标准蛋白A562测量值对其浓度(μg/ml)作图绘制标准曲线，最后，根据标准曲线定量待测样品蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳后转膜。可用考马斯亮蓝染色工作液对凝胶进行染色观察转膜效果。经过1-2 h的膜封闭，进行抗体孵育，4℃震荡过夜；次日，TBST洗涤后，在二抗工作液中室温孵育1-2 h；ECL显影；用凝胶成像系统分析目的蛋白的表达水平。

1.3.6统计学处理

2 结果

2.1 β-二氢青蒿素-大黄素复合物对人胃癌SGC-7901细胞的抑制增殖作用

MTT的结果显示出β-二氢青蒿素-大黄素复合物对人胃癌SGC-7901细胞具有明显抑制增殖作用(见图1)，并显示出β-二氢青蒿素-大黄素复合物对人胃癌SGC-7901细胞的生长呈现出量-效和时-效关系。当β-二氢青蒿素-大黄素复合物分别作用24 h、48 h、72 h时，SGC-7901细胞的IC50分别为7.4 μg/ml、4.6 μg/ml、2.4 μg/ml。

图1 β-二氢青蒿素-大黄素复合物对人胃癌SGC-7901细胞株抑制增殖作用

2.2 β-二氢青蒿素-大黄素复合物对人胃癌SGC-7901细胞的诱导凋亡作用

本实验利用光学显微镜观察经过HE染色的对照组和实验组，从而观察不同浓度的β-二氢青蒿素-大黄素复合物诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的典型的细胞形态学变化。对照组细胞贴壁良好，形态多为梭形或者多角形，伸展性好，分布均匀，生长旺盛，核仁清晰可见，核分裂像较多见；实验组分别加入2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml的β-二氢青蒿素-大黄素复合物，作用48 h后，细胞圆化，体积变小，胞核深染，染色质边集，即胞膜下呈深蓝色的半月形，也可见逐渐增加的凋亡细胞比例和凋亡小体。

Hoechst33258染色48 h后经荧光显微镜观察，对照组细胞发出均匀的蓝色荧光，且细胞形态正常，胞核完整(图2A)；实验组经β-二氢青蒿素-大黄素复合物处理后，细胞变小、圆化，胞浆浓缩，胞核染色质固缩，凝集于胞膜周边，形成月牙形或碎裂成小块状，发出强蓝色荧光，略发白，甚至可见凋亡小体。随着药物浓度的增加，凋亡细胞的形态越明显，凋亡细胞数越多(图2B、图2C、图2D)。

Annexin V/PI双染流式细胞仪检测分析，分别采集对照组和实验组早期凋亡，中晚期凋亡及坏死细胞的信息，并绘制成图像。图像分为四个象限，左下象限为不被 Annexin V和PI染色的活细胞；右下象限为仅被Annexin V染色的早期凋亡细胞；左上象限主要为坏死细胞，甚至是机械性损伤的细胞；右上象限为可被Annexin V和PI同时染色中晚期凋亡细胞[11](见图3、4)。经β-二氢青蒿素-大黄素复合物作用48 h后，实验组早期凋亡率与对照组相比依次增加，且组间具有浓度依赖性。可以客观反映β-二氢青蒿素-大黄素复合物能诱导人胃癌SGC-7901细胞发生凋亡，该数据差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2 Hoechst33258荧光染色实验观察细胞形态(×400倍)

A：对照组 B：2.5 μg/ml实验组 C：5 μg/ml实验组 D：7.5 μg/ml实验组

2.3 β-二氢青蒿素-大黄素复合物对胃癌SGC-7901细胞抑制增殖作用相关蛋白表达的影响

本实验运用Western Blotting方法检测了细胞周期蛋白CyclinD1和细胞增殖核抗原Ki-67的表达变化。发现β-二氢青蒿素-大黄素复合物作用48 h后明显下调了CyclinD1和Ki-67的表达水平，且药物浓度越高，蛋白表达下调的越明显 (见图5)，可以认为β-二氢青蒿素-大黄素复合物通过调节细胞周期蛋白CyclinD1的表达，干预了细胞增殖周期，抑制其增殖，诱导细胞凋亡。

图3 流式细胞仪分析Annexin V/PI双染凋亡率结果

图4 流式细胞仪分析Annexin V/PI双染结果

图5Western Blotting法对CyclinD1和细Ki-67表达的检测

3 讨论

目前以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物，并对其进行结构修饰，从而提炼出新型的抗肿瘤复合物是现在抗肿瘤药物的研发热点。期望是新型复合物可以发挥原有母体药物的最大抗肿瘤活性，并减少本身的不足，以便使其更好的应用于抗肿瘤治疗中。本实验所用的β-二氢青蒿素-大黄素复合物是由经典抗肿瘤中草药-二氢青蒿素和大黄素单体通过酯键结合所形成的，而大量研究早已证明二氢青蒿素和大黄素的抗肿瘤作用[12，13]。那么β-二氢青蒿素-大黄素复合物是否具有比二氢青蒿素和大黄素更强的抗肿瘤作用呢？回答是肯定的，本实验已证明了这一点。通过前期实验证明：同等剂量，相同时间，同种细胞株的情况下，β-二氢青蒿素-大黄素复合物的细胞毒作用优于大黄素和二氢青蒿素，且对正常细胞没有伤害。我们的实验证实β-二氢青蒿素-大黄素复合物可以诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡，抑制增殖，其作用机制与下调了细胞周期相关蛋白CyclinD1和增殖型抗原Ki-67蛋白的表达密切相关。为该复合物具有抗肿瘤作用提供了初步的实验依据，也浅析了其应用于胃癌治疗的可行性，希望能为更好地开发β-二氢青蒿素-大黄素复合物的药用价值提供帮助。