几种发酵基质对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响*

江胜滔，林美花

（1.宁德师范学院，福建 宁德 352106；2.福建师范大学，福建 福州 350108）

食用菌菌糠（EFR）是在食用菌采摘后残余的原料物质，即菌渣、菌糠，经过食用菌的生长，菌糠中所含有的粗蛋白、粗纤维、粗脂肪等复合物都得到一定的提高[1-2]。菌糠是经过食用菌的分解得到的农业废弃物，它是安全无毒的。宁德市古田县是“中国食用菌之都”。食用菌产业是古田县的支柱产业，全年产量高达87万t、年产值超过58亿元，全产业链产值超百亿元。随着食用菌产业不断发展，产生了大量的菌糠废弃物，对环境造成了污染。

芽孢杆菌菌体自身能够合成蛋白酶、淀粉酶，脂肪酶等酶类，饲料中添加芽孢杆菌粉剂可以提高饲料转化率[3]，可以在消化道与动物体内的消化酶类一同发挥作用，出现“饲料便”等状况，并且能明显提高动物生长性能和饲料利用率[4]。因芽孢的营养体细胞易保存、存活率高，故通常选用芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂发酵菌种[5]。目前，大部分的菌糠处理方式主要是有机肥化利用，有些也用在生物饲料的生产上。作为生产微生物饲料添加剂主要使用的发酵菌株，通常是一些外籍菌，而把大黄鱼肠源芽孢杆菌作为发酵菌株，发酵菌糠生产饲料微生物添加剂的研究较少。鉴于此，本研究是利用自主分离筛选的大黄鱼肠源芽孢杆菌LYC-1作为发酵菌株，研究不同的发酵基质对其芽孢量的影响，为高值化利用食用菌菌糠和选择合适的发酵基质生产动物微生物添加剂提供一些依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

芽孢杆菌LYC-1，本实验室保存。

1.1.2 菌糠

三种无霉变腐烂的菇类的供试菌糠，由宁德柘荣县菇场提供。具体如下：

金针菇菌糠（原栽培配方：棉籽壳38%，麸皮32%，淋水陈积杂木屑25%，玉米粉3%，轻质碳酸钙1.5%，过磷酸钙0.5%）、杏鲍菇菌糠（原栽培配方：杂木屑75%、麸皮22%、糖1%、石灰1%、碳酸钙1%）、猴头菇菌糠（原栽培配方：棉籽皮82%，麦麸15%，尿素1%，石膏粉1%，过磷酸钙1%）。

1.1.3 主要仪器

电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9146A，上海精宏实验设备有限公司；

电热恒温培养箱，DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司；

高压自动电热灭菌锅，LDZX-40511，上海申安医疗器械厂；

超净工作台，5W-CJ-ZD，苏州净化设备有限公司。

1.1.4 主要试剂

磷酸二氢钾、碳酸钙，分析纯，国药集团化学试剂有限公司（上海）；

麸皮、玉米粉、豆粕粉，绿色食品农村公司（周口）。

1.1.5 主要培养基

⑴ 活化培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂20 g/L、pH 7.0～7.2；121 ℃灭菌22 min。

⑵ 种子培养基[6]：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、pH 7.0～7.2；121 ℃，灭菌22 min。

⑶ 计数培养基：LB培养基，pH 7.0

⑷ 芽孢杆菌LYC-1的麸皮固体培养基：无水葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、麸皮80%、米糠5%、玉米粉5%、豆粕粉5%、磷酸二氢钾0.3 %、碳酸钙0.2%。

⑸ 菌糠固体培养基制备[7-8]

称量各培养基成分混匀，每种菌糠（杏鲍菇、猴头菇、金针菇）分别做三组培养基；按1∶1的比例每两两做培养基，这同样有三组培养基；再按1∶1∶1的比例一起做一个培养基；共有7组培养基配方，每组再同时做3个组别。每组实验组配方为菌糠80%、无水葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、米糠5%、玉米粉5%、豆粕粉5%、磷酸二氢钾0.3%、碳酸钙0.2%，含水量大约为60%。称量40 g分别分装到250 mL锥形瓶中，进行包装处理后在121 ℃下灭菌30 min。灭菌后取出冷却至60～70 ℃，晃动锥形瓶，使培养基完全散开成颗粒状，直至无块状为止，备用。

1.2 方法

1.2.1 菌糠的处理

菌糠的加工方法：在食用菌采摘完后（一般收获子实体2～3茬）后，把剩余的原料晒干，清理原料上的残土，并去除霉变、污染的原料，选择子实体及菌丝含量高、松软、且气味芳香的培养料，然后用粉碎机粉碎即成。

1.2.2 芽孢数的检测

在无菌操作台上操作，用电子天平称取处理完成的菌糠25 g，置于研钵内，加入225 mL无菌生理盐水，研磨。研磨充分后，放置于无菌均质器中，用速度为8000～10000 r/min混合1 min，形成1∶10的均匀稀释液。再吸取此时的稀释溶液1 mL，加入含有9 mL无菌生理盐水的试管内，摇匀，形成1∶100的稀释液。

按照前面步骤重复稀释至稀释度分别为 10-5、10-6、10-7，以确保实验的精确度[8-11]。每稀释度各取菌液0.1 mL均匀涂布于LB培养基，每个稀释度个3个平行，放置于37 ℃培养箱中倒置培养24 h，进行菌落计数。

1.2.3 种子液的制备

从芽孢杆菌LYC-1的斜面中，用接种环挑取2环菌种接入液体培养基中，于37 ℃，200 r/min恒温摇床中培养24 h，为种子液备用。

1.2.4 接种与培养

取种子液2 mL（接种量按培养基干重的5%[v/w]），于菌糠培养基中，充分搅拌均匀[12]。将其转入250 mL锥形瓶中，使各锥形瓶中料层厚度和重量均等，约为2 cm，40 g。后放置于37 ℃生化恒温培养箱中培养24 h，中间扣瓶翻料一次，再取样测定发酵后的活菌数(CFU/ g)和芽孢数(CFU/ g)。

1.2.5 三种菌糠不同组合的菌糠对LYC-1芽孢数的影响

以肠源芽孢杆菌固体发酵常规培养基为对照组CK，以金针菇菌糠、猴头菇菌糠、杏鲍菇菌糠为底物的培养基分别设为实验组T1、T2、T3；金针菇菌糠与猴头菇菌糠（1∶1）培养基设为实验组T4；金针菇菌糠∶杏鲍菇菌糠（1∶1）培养基设为实验组T5；猴头菇菌糠与杏鲍菇菌糠（1∶1）培养基设为实验组T6；金针菇菌糠、猴头菇菌糠、杏鲍菇菌糠（1∶1∶1）比例配制培养基为T7。

再用这7种培养基，按1.2.4的方法接种与培养后，按1.2.2的方法测定它们的芽孢数，并选择获得芽孢数量最多的培养基为后续实验的菌糠培养基作为对照组。

1.2.6 玉米粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响

以1.2.5中实验得到的糠菌培养基作为对照组，在糠菌培养基中分别额外添加2%、3%、4%、5%、6%五个梯度玉米粉，按1.1.5⑸方法处理后，作为5个实验组，置入恒温培养箱37 ℃培养24 h，采用菌落计数法计算培养料中的芽孢数。以下同。

1.2.7 豆粕粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响

豆粕粉分别以2%、3%、4%、5%、6%五个梯度额外添加，其余成分与1.2.5得到的糠菌培养基配方一致，配置固体发酵培养基，放入恒温培养箱37 ℃培养24 h，计算培养料中的芽孢数。

1.2.8 米糠不同添加量对LYC-1芽孢数的影响

米糠分别以2%、3%、4%、5%、6%五个梯度额外添加，其余成分与1.2.5得到的糠菌培养基配方一致，配置固体发酵培养基，放入恒温培养箱37 ℃培养24 h，计算培养料中的芽孢数。

1.2.9 磷酸二氢钾不同添加量对LYC-1芽孢数的影响 磷酸二氢钾分别以0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4% 五个梯度额外添加，其余成分与1.2.5得到的糠菌培养基配方一致，配置固体发酵培养基，放入恒温培养箱37 ℃培养24 h，计算培养料中的芽孢数。

1.2.10 碳酸钙不同添加量对LYC-1芽孢数的影响

碳酸钙分别以0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%五个梯度额外添加，其余成分与1.2.5得到的糠菌培养基配方一致，配置固体发酵培养基，放入恒温培养箱37 ℃培养24 h，计算培养料中的芽孢数。

1.3 统计分析

试验数据用“平均数±标准差”表示，实验结果采用Excel 2007和SPSS 21.0版统计软件对所得数据进行单因素方差分析和LSD多重比较，显著性水平设为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 三种菌糠不同组合的菌糠对LYC-1芽孢数的影响

由于三种不同的食用菌的栽培配料不同，不同菌糠和不同的菌糠组合含有的营养成分也不一样，它们对芽孢杆菌LYC-1的菌体的生长、繁殖以及形成的芽孢量具有一定的影响。图1表明，实验组T1芽孢数最多，为(5.58±0.19)×109CFU/g；实验组T2芽孢数最少，为(2.70±0.15)×109CFU/g；对照组CK为(4.99±0.63)×109CFU/g，实验组T3、T4、T5、T6、T7的芽孢数分别为(4.48±0.83)×109CFU/g、(3.92±0.79)×109 CFU/g、(4.97±0.77)×109CFU/g、(3.68±0.59)×109 CFU/g、(3.92±0.68)×109CFU/g。与CK相比较，实验组T2和T6的菌糠培养基对芽孢量的减少有显著影响，而T1、T3、T4、T5、T7的菌糠培养基对芽孢量的减少没有显著影响，说明T2(猴头菇菌糠)和T6（猴头菇菌糠∶杏鲍菇菌糠=1∶1）的不宜替代麸皮固体培养基，而金针菇菌糠和杏鲍菇菌糠都可以替代麸皮。从图1可知，T1芽孢量最多，故选择金针菇菌糠为主要原料的菌糠培养基为对照组，研究其它基质对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响程度。

图1 常规培养基与不同组合的菌糠培养基对肠源芽孢杆菌芽孢数的影响（109 CFU/g）

2.2 玉米粉不同的添加量对LYC-1芽孢数的影响

在微生物的各种营养需求中，碳源既能满足生物的合成需要，又能为细胞提供能量，对碳的需要量最大[13]。如图2所示，芽孢杆菌LYC-1芽孢量从玉米粉添加量0%到5%之间，随着添加量增加，芽孢量呈缓慢的增加趋势，在5.0%时达到最大值，为(6.89±0.40)×109CFU/g，添加量超过5.0%时，芽孢量呈下降趋势；与对照组相比较，玉米粉的添加量3.0%、4.0%、5.0% 、6.0%对芽孢杆菌LYC-1芽孢量具有显著影响，而添加量为2.0% 时，芽孢量为(5.71±0.21)×109CFU/g，对芽孢杆菌LYC-1芽孢量没有显著影响。

图2 玉米粉添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响

2.3 豆粕粉不同的添加量对LYC-1芽孢数的影响

如图3所示，芽孢杆菌LYC-1芽孢量从豆粕粉添加量0.0%到3.0%之间，随着添加量增加，芽孢量呈快速增加趋势，在3.0%时达到最大值，为(7.50±0.74)×109CFU/g，当添加量超过3.0%时，芽孢量呈缓慢下降趋势；与对照组相比较，豆粕粉的添加量3.0%、4.0%、5.0% 、6.0%对芽孢量具有显著影响，而添加量为2.0% 时，对芽孢杆菌LYC-1芽孢量没有显著影响。

图3 豆粕粉添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响

2.4 米糠不同添加量对LYC-1芽孢数的影响

如图4所示，芽孢杆菌LYC-1芽孢量从米糠添加量0.0%到4.0%之间，随着添加量增加，芽孢量呈平缓的增加趋势，在4.0%时达到最大值，为(6.76±0.47)×109CFU/g，添加量超过4.0%时，芽孢量呈陡然下降趋势；与对照组相比较，米糠的添加量4.0%时对芽孢杆菌LYC-1芽孢量具有显著影响，而米糠添加量为2.0%、3.0%、5.0%、6.0% 时，对芽孢杆菌LYC-1芽孢量没有显著影响。

图4 米糠添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响

2.5 磷酸二氢钾不同添加量对LYC-1芽孢数的影响

不同种类的微生物对无机盐的需求具有差异性，而微生物合成某种代谢产物对无机盐的选择也迥然不同[14-15]。如图5所示，芽孢杆菌LYC-1芽孢量从KH2PO4添加量 0.00%到0.25%之间，随着KH2PO4添加量增加，芽孢量呈增加趋势，在 0.25%时达到最大值，为（6.76±0.47）×109CFU/g，KH2PO4添加量超过0.25%时，芽孢量呈下降趋势；与对照组相比较，KH2PO4的添加量0.25%，对芽孢杆菌LYC-1芽孢量具有显著影响，而KH2PO4的添加量为0.2%、0.3%、0.35%、0.4%时，对芽孢杆菌LYC-1芽孢量没有显著影响。

图5 磷酸二氢钾添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响

2.6 碳酸钙不同添加量对LYC-1芽孢数的影响

如图6所示，芽孢杆菌LYC-1芽孢量从CaCO3添加量0.00%到 0.20%之间随着碳酸钙添加量增加，芽孢量呈平缓增加的趋势，在0.2%时达到最大值，为(6.16±0.47)×109CFU/g，碳酸钙添加量超过0.2%时，芽孢量呈缓慢的下降趋势；与对照组相比较，CaCO3不同的添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量都没有显著影响。

图6 碳酸钙添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响

3 讨论

菌糠经过了食用菌的利用而被吸收了大部分的营养物质，但作为生物质废物而言，其中所含有的有机物质、氮素以及各类微量元素等还是相当丰富的[13]，经过芽孢杆菌LYC-1的发酵生产的动物微生态制剂，成本低，实现了高值化利用，减少了菌糠废弃物对环境造成的污染。从图1中柱形图进行比较，可看出猴头菇菌糠不宜替代粗麸皮作为该菌的培养基原料，这可能由于猴头菇菌糠中的菌丝体含有猴头菌素Fr-3-1，它对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，肠源芽孢杆菌LYC-1也是革兰氏阳性菌，有可能受到猴头菌素的抑制，这在后续的实验中进一步论证。杏鲍菇菌糠、金针菇菌糠及其它们的组合都适宜替代麸皮固体培养基中占80%以上的麸皮作为主要原料来生产微生态制剂。杏鲍菇生长周期短、生物转化率低，培养料中的营养成分未被充分分解利用[14]，而且其菌糠含有丰富的菌体蛋白。金针菇菌糠蛋白质中总氨基酸含量为55.29%，氨基酸种类齐全，必需氨基酸占总氨基酸量的37.62%，相对于鸡蛋蛋白(标准蛋白)的贴近度为0.7741[15]，非常适合作为麸皮的替代原料生产益生菌。

不同的发酵基质对芽孢杆菌LYC-1芽孢量的影响差异不同。本实验以金针菇菌糠培养基为对照组，分别添加不同比例的玉米粉、豆粕粉、米糠和磷酸二氢钾、碳酸钙等发酵基质作为实验组，研究这几种基质对芽孢杆菌LYC-1芽孢量影响的差异性。结果表明，玉米粉对芽孢量的增长有显著影响，适宜作为芽孢杆菌固体培养基的发酵基质，这是由于玉米粉富含B族维生素和淀粉，为芽孢杆菌LYC-1提供了碳源和生长因子；豆粕粉可以为芽孢菌生长提供一定的碳源、氮源以及生长因子，其粗蛋白质含量很高，达到45%以上，是生产中最常用的氮源原料之一，对芽孢量的提高有很大影响；4.0%米糠的添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量具有显著影响，这由于米糠含有丰富的B族维生素、脂肪酸和矿质元素，给微生物提供碳源及维生素等丰富的生长因子，影响着菌体的生长，但米糠不宜添加过多，因为米糠中含有糠醛，对微生物生长有负面影响，且米糠中含有较多的脂肪酸，微生物通过脂肪酸的β-氧化，需要消耗较多能量，降低碳源的利用效率。无机盐磷和钙不仅为微生物提供生长代谢所需的离子，同时保持细胞内渗透压和pH的稳定，维持机体正常生命活动，同时，Ca2+还能提高水解酶的活性；磷酸二氢钾的添加量0.25%，对芽孢杆菌LYC-1芽孢量增加具有显著影响，而CaCO3添加量对芽孢杆菌LYC-1芽孢量都没有显著影响，但CaCO3添加对调节物料的pH有一定作用。分析其原因是金针菇栽培配方中含有1.5%的轻质CaCO3，故在其菌糠中残留未利用的CaCO3，足够提供发酵中Ca2+的需求。

综上所述，金针菇菌糠和杏鲍菇菌糠可以完全替代麸皮，添加5.0%豆粕、5.0%玉米粉、4.0%米糠、0.25%磷酸二氢钾都对提高芽孢量有显著影响，这为高值化利用食用菌菌糠和选择合适的发酵基质生产动物微生物添加剂提供了参考。