瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析

洪国君，邹纯才，鄢海燕，王莉丽，吕文雅

瓜蒌用于胸癖症的治疗始见于汉代名医张仲景所著的《金匮要略》[1]。瓜蒌滴丸是在瓜蒌片(国药准字Z31020173)剂型的基础上[2]，经提取溶剂和瓜蒌皮、子配比优化等，制备瓜蒌提取物[3]，进一步添加聚乙二醇辅料制备而成，用于冠心病、心绞痛等预防与治疗。本研究采用HPLC-PDAD法建立10批瓜蒌滴丸[4]的化学指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(国家药典委员会，2012.130723版本)计算瓜蒌滴丸的相似度，采用标准曲线法测定瓜蒌滴丸中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的含量[5]，以期为瓜蒌滴丸的质量控制提供理论依据。现作报道。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 岛津LC-20A型高效液相色谱仪(含GDU 20A真空在线脱气机，LC-20AT四元泵，CTO-10AS柱温箱，SPD-M20 A检测器)，AUW-220D型电子天平(日本岛津公司)，UV2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)，DZF-6030A型真空干燥箱(上海恒一科技有限公司)。

1.2 实验材料 瓜蒌滴丸(课题组自制，规格25 mg/丸，每丸相当于原瓜蒌生药0.167 g，批号20170701～20170710);尿嘧啶(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥98%，批号20150417)，次黄嘌呤(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥98%，批号20140928);鸟苷(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥98%，批号20140522)，腺苷(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥98%，批号 20150528)，甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 溶液制备 (1)对照品溶液制备：取尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷对照品，于硅胶干燥器中干燥12 h。分别取适量，精密称定，加15%甲醇制得质量浓度分别为66.6、31.25、133.3、200 μg/mL的混合对照品溶液。(2)瓜蒌滴丸供试品溶液制备：取瓜蒌滴丸适量，精密称定，置于容量瓶中，加15%甲醇定容至刻度，制得75 mg/mL供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤后，备用。

1.3.2 色谱条件 YMC-Pack ODS-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，I.D.S-5 μm)，以甲醇-水为流动相梯度洗脱：0～30 min，甲醇0%；30～50 min，甲醇0%～2%；50～80 min，甲醇2%～6%；80～200 min，甲醇6%～15%；200～250 min，甲醇15%～15%。总流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；DAD检测器，检测波长为254 nm 。

1.3.3 瓜蒌滴丸指纹特征研究 瓜蒌滴丸及对照品色谱图见图1。根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，设置1号样品色谱图为参照图谱，经多点校正，Mark峰及全谱峰匹配，生成对照图谱，得到共有峰的数目为29个。其中2、5、13、19号峰分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷。计算10批瓜蒌滴丸的指纹图谱与共有模式的相似度。

1.3.4 瓜蒌滴丸的定量分析

1.3.4.1 标准曲线的建立 精密吸取混合对照品溶液，稀释1、2、4、8倍，按“1.3.2”项下色谱条件进样。以对照品溶液质量浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

1.3.4.2 精密度考察 取瓜蒌滴丸(批号20170701)适量，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.2”项下色谱条件，连续进样5次。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷峰面积的RSD分别为0.55%、2.24%、2.32%、1.49%，表明仪器精密度良好[6]。

1.3.4.3 稳定性考察 取瓜蒌滴丸(批号为20170701)适量，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.2”项下色谱条件，分别在0、6、12、18、24 h进行测定。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷峰面积的RSD分别为1.22%、0.89%、1.18%、4.23%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

1.3.4.4 重复性考察 取同批瓜蒌滴丸6份，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.2”项下色谱条件测定。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷平均含量的RSD分别为3.55%、1.56%、0.95%、1.85%，表明方法重复性良好。

1.3.4.5 加样回收率试验 取已知尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷含量的瓜蒌滴丸(批号为20170701)供试品溶液9份(每份10 mL)，分为3组，每组3份，每份1 mL，每组分别按尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷已知含量的80%、100%、120%精密加入对照品。按“1.3.2”项下色谱条件进样测定。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷平均含量的RSD分别为3.17%、4.44%、4.15%、3.32%，满足分析要求(见表2)。

2 结果

计算10批瓜蒌滴丸的指纹图谱与共有模式的相似度，结果显示，10批瓜蒌滴丸的相似度为0.99±0.01(Mark峰匹配)和0.97±0.02(全谱峰匹配)(见图2)。瓜蒌滴丸中4种成分的定量分析结果显示，尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的含量分别为(0.25±2.66)%、(0.15±4.98)%、(0.38±2.51)%、(0.61±1.86)%。

表2 瓜蒌滴丸中4种成分的加样回收率试验结果

续表2

对照品样品中量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均 回收率/%RSD/%36.6481.7398.145.8093.55104.2腺苷45.8045.8091.3399.4101.23.3245.8092.59102.154.9699.5597.854.9699.0096.854.96102.32102.8

3 讨论

瓜蒌滴丸为瓜蒌的水提醇沉浓缩物加聚乙二醇4000、6000制备的滴丸制剂。从瓜蒌分离得到的皂苷类物质几乎全为新化合物，具有抑制炎症、抗肿瘤等活性[7],瓜蒌中含有的腺苷也被证实具有较强的抗血小板聚集活性[8]，且有紫外吸收[9-10]，为此本研究采用HPLC-PDAD技术对瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种核苷类成分进行定量分析。

实验过程中，考察了YMS-C18、ZorbaxC18、XB-CN等色谱柱，并对流动相甲醇、乙腈与水、0.1%磷酸水、0.1%醋酸水、0.1%三乙胺水溶液的联合应用进行了考察，结果发现YMS-C18色谱柱为固定相，甲醇-水作流动相分离效果较好。从实验结果可知，不同批次的瓜蒌滴丸化学指纹特征相似度较高，Mark峰和全谱峰匹配的相似度分别为0.99和0.97，故设定瓜蒌滴丸的化学指纹特征相似度阈值为0.95。本实验亦对瓜蒌滴丸中的尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷等成分进行了定量分析方法建立，结果显示，该方法精密度、重复性、稳定性及加样回收率试验的RSD最高值分别为2.24%、3.55%、4.23%和4.44%，可满足定量分析的要求。

综上，瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析，可用于瓜蒌滴丸的质量控制。结合瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析及后期的药效学研究，可为深入进行瓜蒌滴丸的谱效关系研究奠定基础。