艾滋病模型中关键指标SIV DNA 绝对定量微滴式数字PCR 技术的创新应用

张丽丽,陆佳涵,薛 婧,丛 喆,魏 强

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫健委人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室,北京 100021)

SIV 感染恒河猴后,猴体内可产生持续性感染并形成病毒的储存库,与HIV 感染人的过程极其类似[1]。 清除储存库的策略研究是当前艾滋病研究中的热点,因此准确评估病毒储存库的大小就显得非常重要。 目前常用的病毒储存库的定量检测方法是实时荧光定量PCR, 即qPCR,该方法通过标准曲线计算出样本中的病毒DNA 拷贝数,实现相对意义上的“绝对定量”[2]。 数字PCR(digital PCR,dPCR)是近年来发展成熟起来的新技术,相比于qPCR 定量不需要依赖标准品,能直接检测出样品中的拷贝数,实现真正意义上的绝对定量[3]。

本研究依托 Bio-Rad 公司微滴式 dPCR(ddPCR)技术平台,建立了SIV DNA 载量的绝对定量方法,并对微滴式dPCR 用于SIV DNA 检测的范围及准确性进行评估,以期为病毒储存库的定量提供可靠的技术保障。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒标准品

所用pGEM-SIVgag477 质粒,是将SIVmac251病毒RNA gag 基因上1360 ～1837 之间长度为477 bp 的片段克隆到pGEM T 载体上构建而成,由中国医学科学院医学实验动物研究所艾滋病课题组制备并保存[4]。 对该质粒进行10 倍系列稀释,取浓度分别是1、10、102、103、104、105、106、107copies/μL 的8 个标准品进行本研究,同时设置PCR 水为阴性对照(Neg)。

1.1.2 样本

本研究中所用7 份DNA 样本均是从SIV 感染猴外周血PBMC 中提取,对应编号依次是S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7。

1.2 主要试剂与仪器

试剂盒为病毒核酸提取使用QIAamp® DNA Mini kit ( QIAGEN, 51306 )； TaqManTMGene Expression Master Mix (Thermo Fisher, 4369016)用于实时荧光定量PCR,微滴式dPCR 中用到的ddPCRTMDroplet Reader oil (Bio-Rad, 1863004)、Droplet Generation Oil for Probes ( Bio-Rad,1863005)、ddPCRTMSupermix for Probes(Bio-Rad,1863023)。 引物和探针由invitrogen 公司合成(表1),加水稀释至10 μmol/L 备用[5]。

表1 微滴式dPCR 检测SIV DNA 载量所使用的引物和探针Table 1 Primer and probe sequences for the quantification of SIV DNA detected by droplet dPCR

1.3 实验方法

1.3.1 微滴式dPCR 实验

主要实验步骤如下:首先配制20 μL 定量反应体系(混合液10 μL,900 nmol/L 的引物1.8 μL,250 nmol/L 的探针0.5 μL,5.0 μL 的DNA 模板,补充水至20 μL),然后将其加入到DG8 cartridge 中间一排的8 个孔内,在最底下一排8 个孔中各加入70 μL 微滴生成油(DG Oil),盖上胶垫,开始生成微滴。微滴生成于cartridge 最上面一排孔内,将生成的油滴转移到96 孔板中,封膜后进行PCR 反应,最后用QuantaSoft 软件进行数据读取。 微滴式dPCR 反应条件:95℃10 min(×1),95℃30 s(×40),60℃1 min(×40),98℃10 min(×1)。

1.3.2 退火温度的优化

本研究中,根据qPCR 的退火温度,选择57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃六个温度进行实验,优化ddPCR 的退火温度。 模板选择使用104的pGEM-SIVgag477 质粒标准品,将扩增拷贝数最高的温度确定为最佳的退火温度。

1.4 统计学方法

利用 QX200 Droplet Digital System 提供的Quantasoft 软件进行ddPCR 反应的图像处理,graphpad 进行显著性差异分析。

2 结果

2.1 微滴式dPCR 信号识别

本研究中,所有反应的微滴生成正常,单个反应的总微滴数均超过10000(图1a),最高是17626,最低是13264,目标分子的分布符合泊松分布的统计学原理[6],保证了后续分析结果的可靠性和准确性。 图1b 中红色为阈值线,阴性反应峰与阳性反应峰明显分开,该方法可准确检测出阴性微滴数与阳性微滴数。

2.2 微滴式dPCR 反应退火温度的优化

ddPCR 退火温度在57℃～62℃之间均能检测到荧光信号。 57℃、62℃所得拷贝数较低,分别为(346±19.23)copies/μL 和(345±3.68)copies/μL,58℃～61℃测得的拷贝数比较高且接近,60℃时拷贝数最高,为(460±16.97)copies/μL,因此60℃为反应最适退火温度(图2)。

2.3 10 倍系列稀释pGEM-SIVgag477 质粒标准品微滴式dPCR、qPCR 检测结果及两种方法的相关性评估

pGEM-SIVgag477 质粒ddPCR 检测的一维散点图显示,107copies/μL 标准品为全阳性微滴,无阴性微滴(图3a),超出了检测上限；从10 ～106copies/μL的标准品,ddPCR 的检测值在0.3 ～3.96 × 104copies/μL 时,qPCR 与ddPCR 测定结果线性关系良好,r=0.9981,提示该检测方法可靠。 1copies/μL标准品用qPCR 方法未检出(见图3b),ddPCR 方法也大部分显示阴性,虽然个别孔检测出数值,但明显偏离线性曲线,因此也判定为阴性(见表2)。

图1 总微滴数生成柱状图及检测结果直方图Note. a, histogram of total droplet number for pGEM-SIVgag477.b, histogram of test results for different concentrations.Figure 1 Histogram of total droplet number and histogram of test results

2.4 样本检测

分别使用ddPCR 及qPCR 两种方法检测了7份SIV 感染猴PBMC 的DNA 样本。 ddPCR 检测样本的CV 值介于1.34%～16.13%之间,随着拷贝数减少变异系数逐渐增大。 但(1.7±0.14)copies/μL以上的样本检测变异系数均低于10%,显示了良好的稳定性。 S6、S7 的检测结果均小于1copies/μL,CV 值均大于15%(见表3)。

3 讨论

艾滋病毒感染机体后形成的病毒储存库,是目前艾滋病治疗中的最大障碍。 如何准确评估病毒储存库的大小就显得尤为迫切。 第三代PCR 技术——数字PCR 自问世以来,就被寄予厚望。 不同于现阶段被广泛应用的实时荧光定量PCR 技术,它能够直接计算出待检样本的拷贝数,不依赖Ct 值及标准曲线,实现了真正意义上的绝对定量。 尤其近年来在突破了样品分配的瓶颈后,其在生物医药领域的应用越来越广泛,包括拷贝数变异分析[7]、复杂样本基因表达检测[8]以及病毒拷贝数检测[9]等。 本研究中,我们尝试建立了微滴式dPCR 方法,用于定量检测SIV DNA 拷贝数。 结果显示在0.3 copies/μL 到3.96 × 104copies/μL 的范围内,能够实现有效扩增,线性关系良好。 与qPCR 相比,灵敏度基本保持一致。 但随着样本拷贝数的降低,微滴式dPCR 检测结果变异度也还是明显加大,检测结果不太稳定。 如果样本拷贝数超出检测上限,也不能实现有效扩增,需要对其进行稀释后再检测。ddPCR 的检测范围过窄,可能和该技术需要对样本进行极限稀释有关。

另外,本研究还发现,现阶段微滴式dPCR 实验过程稍显繁琐,对操作人员的技术要求较高。 例如整个操作过程需要多次转板易造成样本的损失；加样产生微小气泡妨碍油滴生成,继而导致PCR 无法正常扩增。 这些操作可能限制了该技术的普及和大规模使用。 但作为一项新兴技术,微滴式dPCR还是给艾滋病研究带来了很大的惊喜,对艾滋病毒储存库更真实准确地定量检测,将对清除储存库策略研究、抗艾滋病疫苗及药物研究提供有效的技术保障。

图2 ddPCR 不同退火温度下测定pGEM-SIVgag477质粒的拷贝数结果Figure 2 Copy numbers of pGEM-SIVgag477 detected by ddPCR at different annealing temperatures

表2 10 倍系列稀释pGEM-SIVgag477 质粒标准品qPCR 及ddPCR 检测结果Table 2 10-fold serial dilution output of pGEM-SIVgag477 detected by ddPCR and qPCR

图3 标准品扩增一维散点图及不同检测方法相关性评估Note: a, One-dimensional scatter plot of pGEM-SIVgag477 detected by ddPCR. b, liner correlation analysis of ddPCR and qPCR.Figure 3 One-dimensional scatter plot and liner correlation analysis

表3 ddPCR 及qPCR 测定SIV 感染猴PBMC 中total DNA 拷贝数结果Table 3 The results of DNA samples detected by ddPCR and qPCR separately