炙甘草汤对糖尿病性心肌病模型大鼠心功能的影响

胡鹏飞 陆 明 杨 明 黄抒伟

糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的重要心血管并发症，独立于冠心病或高血压性心脏病之外，临床多表现为心功能不全[1]。其致病机制复杂，目前认为主要由于长期高血糖，心肌能量代谢异常，导致心肌细胞凋亡，胶原沉积，间质纤维化，从而造成心脏收缩及舒张功能下降[2-3]。近期研究表明，自噬也参与DCM 的病理生理机制，自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，对细胞维持本身代谢需求及内环境稳态有重要意义[4-5]。DCM可归属中医“心悸”“怔忡”“胸痹”“惊悸”“胸 痛”“真心痛”等范畴。炙甘草汤源自汉代张仲景《伤寒论》，临床具有改善心功能之功效。本研究观察炙甘草汤对DCM 模型大鼠心功能的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级雄性SD 大鼠40 只，120～140g，浙江中医药大学动物实验研究中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，动物伦理批号：2017243。自由饮水，饲养环境（21±2）℃，湿度环境（55±5）%。动物合格证号：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 药 物 炙甘草汤制备：炙甘草12g，生姜、桂枝各9g，人参6g，生地50g，阿胶（后烊化）6g，麦冬、麻仁各10g，大枣10 枚，购自浙江中医药大学附属第二医院中药房，加水780mL（按每克生药加水6mL），冷水浸泡30min，煮沸后再文火慢煎40min，趁热过滤滤液，自然滴尽，二煎加水520mL（按每克生药加水4mL），煮沸后，文火慢煎40min，趁热过滤滤液，自然滴尽，合并滤液，内阿胶烊化，95℃水浴浓缩至130mL，浓度为1mg/mL。

1.3 试 剂 Bcl 相关X 蛋白（Bcl-associated X protein，Bax 批号5023S），B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批 号15071S），P62（SQSTM1/P62，批号16177S），自噬标记蛋白Beclin-1（Beclin-1，批号4122S），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH，批 号5174S）抗体购自美国CST 公司；微管相关蛋白1 轻链3-Ⅰ/Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ，批号ABC929）抗体购自美国Sigma 公司，鼠脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP，批号20180112）检测试剂盒购自南京建成科技有限公司；链尿佐霉素（streptozotocin，STZ，批号20171221）购自北京索来宝生物技术有限公司。

1.4 仪 器 小动物超声系统：Fuji film 公司vevo1100 系统；罗氏活力型血糖仪：ACCU-CHEK Active 型，德国罗氏诊断公司生产。

2 实验方法

2.1 分组及造模 先将40 只SD 大鼠进行适应性喂养1 周，开放式供给基础饲料和水。采用随机数字表法将大鼠随机分成正常对照组、DCM 模型组、炙甘草汤低、高剂量组，每组10 只。正常对照组给予低脂饲料饮食，其余三组给予高脂饲料饮食，4 周后四组大鼠均行腹腔葡萄糖耐量（intra-peritoneal glucose tolerance test，IPGTT）及腹腔胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT）。DCM模型组及炙甘草汤低、高剂量组出现胰岛素抵抗者给予一次性腹腔注射35mg/kg STZ 的柠檬酸缓冲液（pH4.5）诱导大鼠产生高血糖。正常对照组给予同等体积的柠檬酸缓冲液腹腔注射。1 周后，测定大鼠空腹血糖，连续2 次空腹血糖≥11.1mmol/L 为2 型糖尿病造模成功，纳入后期实验。至STZ 注射后8 周，心超提示左室舒张功能减退提示开始进展为DCM，表明DCM 造模成功。

2.2 给 药 DCM 造模成功后，炙甘草汤低剂量组给予1mL/100g 炙甘草汤灌胃，炙甘草汤高剂量组给予2mL/100g 炙甘草汤灌胃，正常对照组及DCM 模型组给予等量双蒸水灌胃，至STZ 注射后12 周，检测大鼠心功能并处死大鼠获取心肌组织标本。

2.3 指标检测

2.3.1 ELISA 法测定血清BNP 水平 各组大鼠STZ注射前、后12 周取静脉血2mL，37℃水浴15min，2500r/min 离心15min，取上清，-80℃冰箱保存，ELISA 法测定血清BNP 水平。

2.3.2 心脏超声评价心功能 各组大鼠称重后用10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后仰卧固定，采用频率为14MHz 的高频心脏超声探头。取3个心动周期的平均值记录数据。超声学检测指标：左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension，LVESD），左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD），升高左室射血分数（left ventricular ejection fraction，EF），左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，FS）。

2.3.3 Western blot 测定相应蛋白表达水平 取各组大鼠左心室心肌组织，加入液氮后进行研磨，加入含PMSF 的RIPA 裂解液冰上反复震荡裂解30min，13000r/min 离心10min，取上清液，通过BCA 法定量。加入5×loading buffer 上样缓冲液并煮沸5min。电泳时用5%浓缩胶，12%分离胶。电压首先用50V，待指示条带越过浓缩胶后将电压调至120V，指示带到达分离胶底部时终止电泳，后转印至PVDF膜上进行转膜，5%脱脂牛奶封闭2h，分别孵育相应抗体（凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax；自噬相关蛋白P62，LC3-Ⅰ/Ⅱ，Beclin-1） 过夜。TBS-T 洗3 次，每次10min，室温加入二抗孵育1h，ECL 法显影，富士LAS-4000 曝光机上曝光显像，每组标本5 个。

2.4 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件作统计分析，数据用均数±标准差（） 表示，组间两两比较采用单因素方差分析（ANVOA），配对分析采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 炙甘草汤对DCM 模型大鼠血清BNP 的影响DCM 模型组大鼠12 周时血清BNP 水平高于正常对照组（P<0.05），说明DCM 模型造模成功。药物治疗12 周时，与DCM 模型组比较，炙甘草汤低、高剂量组大鼠血清BNP 水平均显著降低（P<0.05），与炙甘草汤低剂量组比较，高剂量组下降更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后血清BNP 水平比较（pg/mL，）

表1 各组大鼠治疗前后血清BNP 水平比较（pg/mL，）

注：正常对照组及DCM 模型组给予等量双蒸水灌胃；炙甘草汤低剂量组给予1mL/100g 炙甘草汤灌胃；炙甘草汤高剂量组给予2mL/100g炙甘草汤灌胃；BNP 为脑钠肽；DCM 为糖尿病性心肌病；与正常对照组比较，aP<0.05；与DCM 模型组比较，bP<0.05；与炙甘草汤低剂量组比较，cP＜0.05

3.2 大鼠心脏超声评价炙甘草汤对DCM 模型大鼠心功能的影响 实验第12 周，与正常对照组比较，DCM 模型组LVESD、LVEDD 增加（P<0.05），EF、FS水平下降（P<0.05）。与DCM 模型组比较，炙甘草汤低、高剂量组LVESD、LVEDD 下降（P<0.05），EF、FS水平升高（P<0.05），与炙甘草汤低剂量组比较，高剂量组大鼠上述心功能指标改善更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3.3 炙甘草汤对DCM 模型大鼠心肌凋亡水平的影响 实验第12 周，Western blot 检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax 表达，与正常对照组比较，DCM 模型组Bax 表达上调，Bcl-2 表达下调（P<0.05）；与DCM 模型组比较，炙甘草汤低、高剂量组Bax 表达下调，Bcl-2 表达上调（P<0.05）；与炙甘草汤低剂量组比较，高剂量组Bax、Bcl-2 表达改善更明显（P＜0.05）。见图1、表3。

表2 各组大鼠心脏超声心功能指标比较（）

表2 各组大鼠心脏超声心功能指标比较（）

注：正常对照组及DCM 模型组给予等量双蒸水灌胃；炙甘草汤低剂量组给予1mL/100g 炙甘草汤灌胃；炙甘草汤高剂量组给予2mL/100g 炙甘草汤灌胃；EF 为射血分数；FS 为左室短轴缩短率；LVESD 为左心室收缩末期内径；LVEDD 为左心室舒张末期内径；DCM 为糖尿病性心肌病；与正常对照组比较，aP<0.05；与DCM 模型组比较，bP<0.05；与炙甘草汤低剂量组比较，cP＜0.05

图1 Western blot 检测各组大鼠心肌凋亡相关蛋白

表3 各组大鼠心肌凋亡相关蛋白表达量比较（）

表3 各组大鼠心肌凋亡相关蛋白表达量比较（）

注：正常对照组及DCM 模型组给予等量双蒸水灌胃；炙甘草汤低剂量组给予1mL/100g 炙甘草汤灌胃；炙甘草汤高剂量组给予2mL/100g炙甘草汤灌胃；Bax 为Bcl 相关X 蛋白；Bcl-2 为B 淋巴细胞瘤-2；GAPDH 为内参；DCM 为糖尿病性心肌病；与正常对照组比较，aP<0.05；与DCM 模型组比较，bP<0.05；与炙甘草汤低剂量组比较，cP＜0.05

3.4 炙甘草汤对DCM 模型大鼠心肌自噬水平的影响 Western blot 检测自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表达，与正常对照组比较，DCM 模型组P62 表达上调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表达下调（P<0.05）；与DCM 模型组比较，炙甘草汤低、高剂量组P62 表达下调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表达上调（P<0.05）；与炙甘草汤低剂量组比较，高剂量组上述指标改变更明显（P＜0.05）。见图2、表4。

4 讨论

糖尿病长期糖、脂代谢紊乱是导致DCM 发病的重要原因之一[6]。糖尿病时心脏能量底物的改变使得心肌能量来源以脂肪酸β 氧化为主[7-8]。此外，脂代谢产生的脂毒性中间产物可使心肌细胞凋亡增多，引起一系列病理生理变化，使心肌重塑，心肌结构和功能的改变最终导致DCM 的发生发展[9]。目前，临床上DCM 诊断尚无统一标准。

图2 Western blot 检测各组大鼠心肌自噬相关蛋白

表4 各组大鼠心肌自噬相关蛋白表达量比较（）

表4 各组大鼠心肌自噬相关蛋白表达量比较（）

注：正常对照组及DCM 模型组给予等量双蒸水灌胃；炙甘草汤低剂量组给予1mL/100g 炙甘草汤灌胃；炙甘草汤高剂量组给予2mL/100g炙甘草汤灌胃；LC3 为微管相关蛋白1 轻链3；P62 为SQSTM1/P62 蛋白；Beclin-1 为自噬标记蛋白Beclin-1；GAPDH 为内参；与正常对照组比较，aP<0.05；与DCM 模型组比较，bP<0.05；与炙甘草汤低剂量组比较，cP＜0.05

自噬在营养供应、能量变化时对维持细胞内代谢平衡具有重要作用[10]。在体内能量代谢紊乱或者营养缺乏时自噬可作为一种内源性的产能方式，两种主要启动自噬的机制为AMP 激活的蛋白激酶（adenosine 5＇-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）AMPK[11]和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 信号通路mTORC[12]。然而，糖尿病状态下能量缺乏时脂代谢异常产生的大量脂毒性中间产物可使心肌细胞凋亡增多[13]。因此，自噬与凋亡都参与了DCM 的发生发展。自噬在DCM 发病机制的各个重要环节中起重要调控作用，包括糖代谢异常、血清游离脂肪酸增高而导致心肌细胞脂毒性，以及氧化应激、胰岛素抵抗导致心肌功能障碍和心脏结构的改变[14]。

炙甘草汤源自汉代张仲景《伤寒论》，方中炙甘草、人参、桂枝常用于DCM 等阴血阳气虚弱证候的治疗，临床具有改善心功能之功效。本研究发现，炙甘草汤能降低DCM 模型大鼠血清BNP 水平，升高EF，改善DCM 模型大鼠心功能，同时发现DCM 模型组大鼠凋亡蛋白Bcl-2 表达下调，促凋亡蛋白Bax表达上调，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Beclin-1表达下调，P62 表达上调，即DCM 大鼠心肌细胞凋亡增多，自噬减弱，而炙甘草汤药物干预可逆转这一现象，高剂量组效果更明显。本研究推测炙甘草汤可能通过增强心肌细胞自噬，自噬作为保护性机制增加心肌细胞清除受损细胞器能力，改善心肌细胞能量代谢，从而抑制心肌细胞凋亡，改善DCM 模型大鼠心功能，但其具体机制及相关信号通路尚不明确，有待细胞实验及进一步动物实验验证。

综上所述，炙甘草汤对DCM 模型大鼠心功能具有保护作用，其机制可能通过增强心肌细胞自噬，自噬作为保护性机制抑制心肌细胞凋亡相关。