臭椿酮对人非小细胞肺癌H460 细胞的抑制机制研究

范敏慧 帅仁亚 王 俊

肺癌是最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的主要原因，占全世界新发癌症病例的17%，在我国肺癌的发病率和致死率在各类肿瘤中居首位[1-2]。临床上，肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占比85%[3]。目前肺癌的治疗主要以放化疗和手术治疗为主，尽管近年来针对肺癌表皮生长因子受体（EGFR）突变的靶向药物如吉非替尼等逐步进入临床，然而靶向药物费用高昂，且后期同样存在耐药情况，因此也驱动着新型药物的研发[4-5]。臭椿酮是一种从中草药臭椿中提取的类古芥酸[6]。研究表明，臭椿酮对体外许多癌症细胞系，包括HepG2 细胞，Hep3B 细胞，R-HepG2 细胞，HeLa 细胞，Huh-7 细胞，SGC-7901 细胞和MCF-7 细胞等，具有明显的抑制效果[7-9]。本课题探究臭椿酮对人非小细胞肺癌H460 细胞的增殖、迁移和侵袭作用，并进一步解析其中的分子机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 人非小细胞肺癌H460 细胞株，购自美国ATCC 公司。H460 细胞于含1%青霉素-链霉素双抗溶液（Penici-llin-Streptomycin Solution，PSG）和10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中生长，并在5%CO2、37°C 下培养。

1.2 中药单体 臭椿酮（Sigma-Aldrich，SML 2143-5MG）溶解于二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，D2650）中，配制成浓度为200μM 的母液，用时稀释至相应的浓度。臭椿酮作用H460 细胞48h，用于后续试验。

1.3 试 剂 CCK8 细胞增殖检测试剂盒（批号00070716）、细胞核染料DAPI（批号0009536）购自上海碧云天生物技术有限公司；结晶紫染色试剂（006423265）购自北京索莱宝科技有限公司；96 孔细胞迁移测定试剂盒（批号2155631）、BME 细胞侵袭测定试剂盒（批号26205126）购自美国Cultrex 公司；Cyclin D1（细胞周期蛋白D1）兔单抗（批号54565482）购自abcam；磷酸化蛋白酪氨酸激酶Src（p-Src）兔单抗（批号2168121）、蛋白酪氨酸激酶Src（Src）兔单抗（批号210825）、磷酸化细胞蛋白激酶B（p-Akt）兔单抗（批号4060451）、细胞蛋白激酶B（Akt）兔单抗（批号254691） 购自美国CST 公司；Alexa Fluor Plus 555 山羊抗兔荧光二抗（批号11011-8613）购自美国Invitrogen 公司；actin 作为内参。

2 实验方法

2.1 CCK8 法检测细胞增殖 将H460 细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96 孔板中。细胞增殖通过CCK8 试剂盒进行测定。药物刺激后将CCK8 溶液添加到培养基中，并放于培养箱37℃孵育1h。使用M5酶标仪在450nm 处测量吸光度。

2.2 细胞迁移/侵袭 分别通过使用Cultrex 96 孔细胞迁移测定试剂盒和Cultrex BME 细胞侵袭测定试剂盒进行迁移和侵袭测定。将H460 细胞在无血清培养基中孵育24h，然后使用消化重悬于无血清培养基中。将具有10%FBS 的培养基添加至下室，并将细胞悬浮液（1×104个细胞）添加至上室。同时上室中加入1.0μM 的臭椿酮，然后在37℃下于5%CO2中孵育24h。最后，按照制造商的说明计算迁移和侵入的细胞。

2.3 Western blot 检 测Cyclin D1、p-Akt、Akt、p-Src、Src 蛋白水平 药物处理细胞48h 后收集蛋白，经过电泳转膜后，5%BSA 封闭1h，过夜4℃孵育一抗（稀释比均为1:1000），洗去一抗后孵育荧光二抗，利用Odyssey 荧光扫膜仪曝光。

2.4 细胞免疫荧光 第一天将细胞铺于细胞爬片上，待细胞生长过夜后加入臭椿酮处理48h，取出细胞，利用4%多聚甲醛组织固定液进行固定处理，0.5% triton-PBS 透膜，5%山羊血清封闭，4℃孵育Cyclin D1 一抗（稀释比1:200），次日洗去一抗后孵育荧光二抗（稀释比1:400），最后利用DAPI 染细胞核。利用FV1000 共聚焦显微镜成像。

2.5 统计学方法 应用GraphPad Prism 5 统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 臭椿酮对非小细胞肺癌H460 细胞增殖的影响CCK8 法检测臭椿酮对非小细胞肺癌H460 增殖的作用，结果表明，与0μM 浓度比较，不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0μM）臭椿酮处理的H460 细胞增殖明显受抑制（P＜0.05 或P＜0.01），见表1。

表1 不同浓度臭椿酮对H460 细胞增殖的影响（%，）

表1 不同浓度臭椿酮对H460 细胞增殖的影响（%，）

注：各组分别用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM 的臭椿酮处理H460 细胞；与0μM 组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

3.2 臭椿酮对非小细胞肺癌H460 细胞迁移/侵袭的影响 通过Cultrex 96 孔细胞迁移法和Cultrex BME 细胞侵袭法检测臭椿酮对非小细胞肺癌H460细胞迁移/侵袭的作用（见图1-2），臭椿酮处理条件下H460 细胞的迁移率和侵袭率明显低于DMSO 组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

图1 臭椿酮对H460 细胞迁移的作用（结晶紫染色，×40）

图2 臭椿酮对H460 细胞侵袭的作用（结晶紫染色，×40）

表2 臭椿酮对H460 细胞迁移侵袭率的影响（%，）

表2 臭椿酮对H460 细胞迁移侵袭率的影响（%，）

注：DMSO 组为DMSO 处理H460 细胞；臭椿酮组为臭椿酮（1.0μM）处理H460 细胞；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.01

3.3 臭椿酮对Cyclin D1 表达的影响 利用细胞免疫荧光实验检测臭椿酮对H460 中Cyclin D1 表达的影响，结果显示，臭椿酮处理条件下，Cyclin D1 阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3，图3。

表3 臭椿酮对Cyclin D1 阳性率的影响（%，）

表3 臭椿酮对Cyclin D1 阳性率的影响（%，）

注：DMSO 组为DMSO 处理H460 细胞；臭椿酮组为臭椿酮（1.0μM）处理H460 细胞；DMSO 为二甲基亚砜；Cyclin D1 为细胞周期蛋白D1；与DMSO 组比较，aP＜0.01

图3 臭椿酮对Cyclin D1 表达的影响（荧光染色，60×）

3.4 臭椿酮对Akt、Src 活化的影响 臭椿酮处理H460 细胞48h 后检测细胞增殖迁移相关信号Akt、Src 磷酸化的变化，结果显示，臭椿酮明显抑制p-Akt、p-Src 的活化以及Cyclin D1 的表达，见图4。

图4 臭椿酮对Akt、Src 磷酸化的影响

4 讨论

在多种癌症中，如胃癌，前庭神经鞘瘤，人类早幼粒细胞白血病和前列腺癌中，臭椿酮具有抗肿瘤活性，具体抗肿瘤机制包括抑制细胞增殖、迁移和凋亡[6，10-12]。然而臭椿酮在肺癌，尤其是非小细胞肺癌中的相关研究仍有不足，特别是其抗肿瘤的分子机制。在本研究中，臭椿酮明显抑制H460 细胞的增殖、迁移和侵袭（P＜0.05 或P＜0.01）。初步机制探究发现，臭椿酮可通过抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1 的表达抑制H460 的增殖（P＜0.01）。此前有多项研究表明，促细胞增殖信号Src 激酶的激活可以调控Cyclin D1 的表达，从而影响细胞的增殖[12-14]。基于此，本研究结果显示，Src 的磷酸化被明显抑制。Akt 信号的激活对于肺癌细胞的迁移和侵袭至关重要[15-16]。因此本文也探究了细胞增殖侵袭相关信号Akt 的磷酸化，结果显示Akt 的磷酸化明显下降。综上推测，臭椿酮可能是通过调控Src 的磷酸化从而抑制Cyclin D1介导的细胞增殖，同时通过抑制Akt 的磷酸化抑制细胞的迁移和侵袭。

综上所述，臭椿酮对非小细胞肺癌的作用机制可能是通过抑制Akt、Src 磷酸化的激活，从而抑制肺癌细胞的恶性进程。