南葶苈子清炒前后高效液相指纹图谱研究*

王 亮，李红伟

（1.郑州市农产品质量检测流通中心，郑州 450001；2.河南中医药大学药学院，郑州 450046）

葶苈子始载于《神农本草经》，味辛、苦，性寒，主癥瘕积聚结气、饮食寒热、破坚逐邪、通利水道[1]。传统认为有甜、苦两种，2015版《中华人民共和国药典》规定其药用来源为十字花科植物播娘蒿Desurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl（又称南葶苈子）和独行菜Lepidium apetalum Willd.（又称北葶苈子）的干燥成熟种子，前者称为甜葶苈，后者称为苦葶苈[2]。葶苈子的炮制方法以清炒炮制为主，最早见于张仲景《金匮要略》葶苈大枣泻肺汤中“葶苈熬令黄”[3]，关于其炮制作用，清代唐宗海认为“不炒则不香，不能散，故必炒用”[4]，目前临床认为“炒后药性缓和，免伤肺气”[5]。

南葶苈子中主要含有异硫氰酸及其硫苷、黄酮、脂肪油类成分，以及强心苷、三萜、甾醇、香豆素、生物碱、酚酸、挥发油、氨基酸等成分，对心血管、高血脂等疾病具有显著功效，所含的成分具有降压、抗癌、细胞毒、抗氧化等药理活性[6]。目前已有南葶苈子指纹图谱方面的研究报道[7-8]，对其生品和清炒品的指标性成分检测多以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷和芥子碱硫氰酸盐含量测定为主[9-12]，尚未见南葶苈子清炒品的指纹图谱研究。因南葶苈子临床传统用药以清炒品为主，因此本研究以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷和芥子碱硫氰酸盐为对照，分别建立南葶苈子生品和其清炒品的HPLC指纹图谱，通过相似度评价和对比研究，探讨南葶苈子清炒前后指纹图谱的变化，为实现南葶苈子清炒品生产过程质量控制、质量信息可追溯提供指纹图谱参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 InfinityⅡ型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；KQ-500V型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（嘉兴市中新医疗仪器有限公司）；OSB-2100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；HX-200型高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；ME204万分之一电子天平（梅特勒·托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试剂和药品 甲醇为色谱纯（批号151282，规格4 L，纯度≥99.9%），乙腈为色谱纯（批号156275，规格4 L，纯度≥99.9%），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；磷酸二氢钠分析纯（批号20180225，规格500 g，纯度≥99.5%），北京化工厂。南葶苈子样品采自河南郑州、安徽亳州、河北安国等地（S1～S12），计12个样本，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为十字花科（Cruciferae）植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl的干燥成熟种子，见表1。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷（批号PS14012301，规格 20 mg，纯度≥98.0%），芥子碱硫氰酸盐（批号PS14031803，规格20 mg，纯度≥98.0%），成都普思生物科技股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱NUCLEODUR C18色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.01 mol/L NaH2PO4水溶液，梯度洗脱：0～6min，1%～6%CH3CN；6～24 min，6%～15%CH3CN；24～32 min，15%～20%CH3CN；32～47 min，20%～28%CH3CN；47～52 min，28%～40%CH3CN；52～54 min，40%～40%CH3CN。流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样量5 μL，色谱分析时间 54 min。

2.2 样品制备

2.2.1 南葶苈子生品制备 取各批次南葶苈子药材，去除杂质，筛去灰屑，备用（S1～S12）[5]。

2.2.2 南葶苈子清炒品制备 取净南葶苈子（S1～S12），置预热的锅内，用文火加热，炒至微鼓起，爆裂声减弱，并有香气逸出时，取出，放凉，备用（相对应炮制品 P1～P12）[5]。

2.2.3 制备对照品溶液 分别称取槲皮素-3-O-β-D-葡糖糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芥子碱硫氰酸盐1.06、1.62 mg，用60%的甲醇溶解并稀释，槲皮素-3-O-β-D-葡糖糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷浓度为21.2 μg/mL，芥子碱硫氰酸盐浓度为 162.0 μg/mL，作为对照品溶液。

2.2.4 制备供试品溶液 分别称取5.0 g南葶苈子生品、清炒品（折合生品质量），粉碎过60目筛，置250 mL具塞平底烧瓶中，加蒸馏水170 mL，超声波400 W，温度70℃提取30 min，提取液离心，取上清液，旋转蒸发仪蒸干，用甲醇溶解并转移至称量瓶中，于50℃下干燥呈浸膏状，真空干燥，恒质量[13]。精密称取干燥固体物50.00 mg，用60%甲醇溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性实验 取南葶苈子生品或清炒品供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样 5 μL，各主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于2%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，表明样品在24 h内稳定。

2.3.2 精密度实验 取南葶苈子生品或清炒品溶液连续进样6次，每次5 μL，各主要色谱峰的相对保留时间均小于1%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，表明仪器的精密度良好。符合指纹图谱的检测要求。

2.3.3 重复性实验 取同批次饮片6份，分别精密称定，按“2.3.2”项下方法分别制备供试品溶液6份，分别进样检测。各主要色谱峰的相对保留时间均小于2%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，符合指纹图谱的检测要求，表明方法的重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立

2.3.4.1 参照峰的确定 按“2.1”项下的色谱条件，采集“2.3.1”项下所制备的混合对照品溶液色谱图，峰1为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰（峰标号26），峰2为芥子碱硫氰酸盐峰（峰标号30）。见图1、2。

图1 混合对照品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances

图2 混合对照品（HB）与南葶苈子清炒品（Z1）HPLC叠加指纹图Fig.2 Overlaying HPLC fingerprint of mixed reference substances（HB）with processed Descurainiae semen（Z1）

2.3.4.2 指纹图谱的采集 按2.1项下的色谱条件，分别采集12批南葶苈子生品、清炒品指纹图谱，标出其相同的共有峰，结果见图3、4。因芥子碱硫氰酸盐峰相应值强，且分离度好，故以芥子碱硫氰酸盐为参照峰，计算其他共有峰的相对峰面积和保留时间，见表 1、2。

2.3.4.3 共有模式的建立 分别将12批南葶苈子生品、清炒品样品色谱指纹图谱数据，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版），以S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1，经多点校正后，中位数法生成对照图谱，生品和清炒品对照指纹图谱见图4。采用相同方法计算生品和清炒品对照指纹图谱的相似度，见表3。

表1 12批南葶苈子生品共有峰相对保留时间/相对峰面积Tab.1 Relative retention time/relative peak area of common peaks in 12 batches of crude Descurainiae semen

表2 12批南葶苈子清炒品共有峰相对保留时间/相对峰面积Tab.2 Relative retention time/relative peak area of common peaks in 12 batches of processed Descurainiae semen

2.3.5 相似度评价 分别对南葶苈子、清炒南葶苈子HPLC指纹图谱进行相似度计算，见表4。相似度结果表明，生品 S1、S3、S4、S8、S9、S10、S11、S12 样品间相似度良好，大于0.9，且与对照指纹图谱相似度均大于0.922。生品S2、S5、S6、S7样品间相似度良好，大于0.919，但与对照指纹图谱相似度小于0.9，与其他生品相似度在0.638～0.888之间，这表明这4批生品与其他生品存在一定的差异，这可能与其成长环境、干燥和贮藏条件等因素有关。清炒后，P1、P4、P8、P9、P10、P11、P12 样品间相似度与对照指纹图谱相似度均大于0.92，相似度相比生品更好；P2、P5、P6、P7 与对照指纹图谱相似度大于0.953，与其他样品相似度大于0.894，以上结果说明，南葶苈子生品间差异较大，大致归为两类，样品S2、S5、S6、S7 为一类，其余样品为一类。清炒后，样品之间相似度得到显著改善，表明建立南葶苈子标准化生产工艺的必要性，清炒炮制能够从一定程度上缓解南葶苈子药间差异，因部分峰面积增大，造成差异减小。这对南葶苈子质量控制、药效一致性研究具有重要意义。

表4 南葶苈子生品和南葶苈子清炒品对照谱相似度Tab.4 Similarities of 12 batches of crude and processed Descurainiae semen

2.3.6 南葶苈子生品与清炒品HPLC指纹图谱比较 以1号样品S1和清炒后P1指纹图谱为例，对比清炒前后差异，见图5。生品中峰面积大于0.25%的色谱峰有 46 个，其中色谱峰 8、9、13、14、15、23、25、26、30、35、41 为清炒前后共有峰。由图 3 可看出，清炒后，0～20 min、42～54 min时间段内色谱峰峰面积减小，共有峰 No.9、No.13、No.14、No.41 峰面积降低，此段成分多为单糖、寡糖、氨基酸类成分（这些成分在254 nm无响应，同时结合紫外吸收和分子极性确定），结合清炒炮制质量标准要求颜色加深，表明此段成分发生了美拉德反应，从而使得清炒品颜色发生褐变、加深[14]。20～42 min时间段内色谱峰响应值增大，其中共有峰No.23、No.26、No.30、No.35峰面积相对生品均升高，非共有峰No.25峰面积升高，清炒工艺对南葶苈子化学成分有一定影响。

图3 南葶苈子生品（S1）、清炒品（P1）共有峰HPLC图Fig.3 HPLC chromatogram of crude（S1）and processed（P1）Descurainiae Semen

图4 12批南葶苈子生品（a）、12批清炒品（b）HPLC叠加指纹图谱Fig.4 HPLC fingerprint of 12 batches of crude（a）and processed（b）Descurainiae semen

图5 南葶苈子生品（RS）和清炒品（RP）对照指纹图谱Fig.5 Fingerprint common model HPLC of crude（RS）and processed（RP）Descurainiae semen

图6 12批南葶苈子生品（a）、清炒品（b）及二者比较（c）系统聚类分析图Fig.6 System clutering analysis chart of 12 batches crude(a)，processed(b)and their compare(c)of Descurainiae semen

2.3.7 系统聚类分析 将12批南葶苈子和清炒南葶苈子作为研究对象，以芥子碱硫氰酸盐为参照峰，计算共有峰相对峰面积，以共有峰相对峰面积为变量，用SPSS 24.0统计软件，采用离差平方和法，对炮制前后指纹图谱进行聚类分析，见图6。结果表明，从图6（a）可看出当聚合距离为5时，生品葶苈子聚为两类，其中 S1、S3、S4、S8、S9、S10、S11、S12 聚为第 1 类，S2、S5、S6、S7 聚为第 2 类，与相似度分析结果一致，表明建立的指纹图谱方法可靠。图6（b）可看出清炒后南葶苈子聚为两类，除了3号样品由第1类归到第2类外，分类结果与生品一致，该结果表明，尽管炮制后12批清炒品相似度得到较大改善，但样品P2、P5、P6、P7与其他样品仍有差别，该结果为相似度评价结果互为补充。从图6（c）12批南葶苈子生品和其清炒品的聚类分析图中可看出，当聚合距离为10时，南葶苈子12批次清炒品聚为一类，这表明清炒后的南葶苈子和生品有明显区别，清炒工艺对南葶苈子的质量控制具有显著作用；生品 S2、S5、S6、S7 聚为一类，其他生品聚类一类，此结果与图 6（c）结果一致，表明生品 S2、S5、S6、S7与其他生品有区别。

3 讨论

本研究首次采用HPLC指纹图谱比较南葶苈子生品与其清炒品化学指纹图谱的差异，结合相似度评价、系统聚类分析法，不仅能对南葶苈子生品和清炒品进行快速准确鉴别，并且能够准确发现两者的区别。所采用的色谱条件重复性好，易于控制，结果直观可靠，方法简便易行，快速有效，可为南葶苈子生品和清炒品的质量评价提供依据。

选用水作为提取溶剂，符合南葶苈子临床用药的水煎煮的特点，利用超声提取，避免了南葶苈子水煎煮容易糊锅的现象，提取工艺采用了超声水提取优化工艺[13]。采用二极管阵列检测器（DAD）采集190～400nm范围内的响应值，通过供试品溶液3D图谱发现，在254 nm条件下，色谱峰响应值较高，峰形对称，峰数较多，分离度较好，基线较为平稳，最终选择254 nm为检测波长。流动相选择，结合参考文献[13]，并进一步的考察优化，选择了乙腈-0.01 mol/L NaH2PO4水溶液为洗脱流动相，优化洗脱程序，基线平稳，色谱峰分离度较好，出峰时间较为适中。故确定流动相为乙腈-0.01 mol/L NaH2PO4水溶液。

目前文献记载南葶苈子的指纹图谱，存在所得图谱共有峰数目少，重复性差等[8]。本实验优化南葶苈子的高效液相指纹图谱测定条件，建立南葶苈子清炒品的指纹图谱。比较南葶苈子生品、清炒品的指纹图谱发现，清炒后南葶苈子通过共有模式建立、相似度评价以及HPLC指纹图谱比较，表明南葶苈子清炒炮制后的HPLC指纹图谱与生品差异较大，清炒后，0～20 min时间段内色谱峰响应值减小，20～42 min时间段内色谱峰响应值增大，如色谱峰槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰（26）、芥子碱硫氰酸盐峰（30），表明清炒炮制对南葶苈子化学成分的溶出有一定的影响。生品HPLC指纹图谱部分批次间差异较大，与其产地来源、加工、干燥、贮藏养护、包装等因素有关，建议尽快建立和完善南葶苈子产地的道地性，产地加工、干燥工艺、贮藏养护、包装工艺规范化和质量标准化。

对于南葶苈子清炒品和生品的HPLC指纹图谱研究还存在不足之处，下一步应扩大样本量，严格按照GMP要求，在控制其产地加工、干燥、贮藏养护、包装等条件下，建立其标准化HPLC指纹图谱或特征图谱，甚至不同产地的HPLC指纹图谱或特征图谱；运用高效液相-质谱联用、超高效液相-质谱联用技术，对南葶苈子清炒炮制前后化学成分进行指认，结合多级质谱裂解技术，探讨其清炒炮制对其化学成分的影响，阐明其清炒机制。