PEG-6000 模拟干旱胁迫下高粱种子萌发期抗旱、敏感材料筛选、鉴定

2020-06-22王平王春语丛玲张丽霞

山西农业大学学报（自然科学版） 2020年3期

王平，王春语，丛玲，张丽霞

（辽宁省农业科学院高粱研究所，辽宁沈阳110161）

干旱是农作物种植过程中经常面临的非生物逆境之一，从播种到结实作物生长发育的各个阶段，缺雨或天气炎热等造成的干旱胁迫都会影响作物生长，导致减产或绝产。高粱为C4植物，基因组结构相对简单，且用途多样，抗逆性强，因此对其研究日益广泛和深入［1］。

高粱抗旱性极强，已成为探究植物抗旱分子机制、挖掘抗旱相关基因的重要模式生物［2］。高粱抗旱相关研究多集中在干旱胁迫处理前后其形态结构及生理指标的变化［3，4］。近年来相继定位到一些抗旱相关QTLs，但多数与开花前和开花后抗旱性有关，包括Stg1、Stg2、Stg3、Stg4、PfrC、PfrE、PfrF和PfrG等［5～7］。然而高粱从用途角度可分为甜高粱、粒用高粱、饲草用高粱和帚用高粱等，不同类型材料间因农艺性状差异导致抗旱能力有所不同。在高粱种质资源抗旱性鉴定中，通常忽略了不同用途类型、株高和熟期之间抗旱能力的差别，在同一试验条件下混合比较，如在种子萌发期高粱抗旱材料筛选试验中，选用了保持系、恢复系和杂交种作为抗旱的筛选材料，最终选出的高粱种子萌发期抗旱性强的材料，因材料类型，熟期和株高都不同，很难对不同实验室的筛选鉴定结果进行比较。高粱每个生长发育时期抗旱性均可能存在显著差异，如B35 开花前期对干旱敏感，开花后期抗旱，而在种子萌发期抗旱性中等［8，9］，因此如不限定材料类型、生长发育阶段和株高等相关农艺性状是无法高效筛选出抗旱和敏感材料。

种子萌发期是高粱生长发育的关键时期，对高粱群体数量和结构起决定作用。干旱条件下，高粱出苗情况依赖于发芽速度和整齐度，这取决于种子在低水分条件下的发芽能力［10，11］。近年来北方高粱主产区春季播种期间多风少雨，种子在萌发期饱受干旱袭扰，因此萌发期的抗旱性尤为重要。然而，基于同一材料类型、综合筛选萌发期高粱抗旱材料的研究报道较少。为了提高抗旱和干旱敏感材料的筛选效率和准确性，本研究对收集的575 份材料通过PEG-6000 模拟干旱条件筛选种子萌发期同一类型、熟期和株高相近，但抗旱性显著不同的高粱材料，为挖掘种子萌发期抗旱基因群体构建奠定材料基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从全球高粱产区收集到不同用途高粱材料，包括甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和农家种等，共计575 份。

1.2 试验方法

选取籽粒饱满、均匀一致且无病虫害的种子100 粒，均匀平铺于垫有3 层滤纸的发芽盒（10 cm×10 cm×7 cm）中，分别加入15 mL 纯净水或不同浓度的 PEG - 6000（15%、17.5%、20%、22.5%、25%）水溶液，置于人工气候室28 ℃处理10 d（16 h Light/8 h Dark）后，出苗以 2 片子叶变绿展开为准，统计种子的（相对）出苗率。

出苗率=（种子的实际出苗株数/种子总粒数）×100%

相对出苗率=（处理后种子的实际出苗率/对照种子出苗率）×100%

试验重复3 次，求平均值进行统计。

统计标准如下：（相对）出苗率一级：80%～100%；二级：60%～79.99%；三级：40%～59.99%；四级：20%～39.99%；五级：0%～19.99%。

1.3 农艺性状测定

供试材料连续3 年（2015-2017 年）种植于辽宁省农业科学院沈阳试验基地用于农艺性状测定。播种后，当小区50%高粱幼芽“露锥”时直至本小区50%的植株穗从旗叶鞘中抽出的天数记录为抽穗期（d）。植株达到完熟期，随机选取5 株用直尺测量植株自地表到穗顶的高度记录为株高（cm）。收获脱粒后目测籽粒颜色和籽粒大小。籽粒颜色分为4 种，包括白色、黄色、橙色和红色。籽粒大小分为小粒、中粒和大粒3 种类型。

1.4 数据统计及显著性分析

用Excel 2010 整理数据并计算不同PEG-6000浓度梯度处理后种子的（相对）出苗率的平均值、标准误以及图形绘制。用SPSS 20.0 进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 种子萌发期出苗率

不同高粱材料之间在正常情况下出苗率存在较大差异，本身出苗率的高低将影响高粱种子萌发期抗旱性鉴定的准确性。575 份高粱材料在水培养条件下，出苗率达到一级、二级、三级、四级和五级的样品数分别为 488 份、62 份、18 份、5 份和 2份，分别占总样品比例为84.87%、10.78%、3.13%、0.87%和0.35%。其中，488 份出苗率达到一级的高粱材料中，出苗率介于80%～89.99%共有142 份，出苗率介于90%～100%共有346 份，分别占总样品比例为24.7%和60.17%。346 份材料中，3 次重复试验出苗率均≥90%的材料共计301 份，这些材料将用于进一步抗旱和敏感材料筛选、鉴定。

2.2 种子萌发期高粱抗旱和敏感材料筛选

根据前期的研究经验［9］，选择 17.5% PEG-6000 模拟干旱胁迫作为抗旱和敏感材料的筛选浓度筛选301 份高粱材料。在此模拟干旱胁迫条件下，相对出苗率达到一级、二级、三级、四级和五级的样品数分别为 63、161、51、26 和 0 份，分别占总样品比例为20.93%、53.49%、16.94%、8.64%和0%。

17.5% PEG-6000 胁迫处理后，其中26 份材料的相对出苗率显著降低（＜40%），为了筛选到对模拟干旱胁迫更加敏感的材料，适度降低选择压力。15% PEG-6000 处理后，26 份材料中 11 份材料相对出苗率在80%～86.5%之间，15 份材料相对出苗率在70%～79.5%之间。结果表明，这26 份材料对模拟干旱胁迫极为敏感，可作为种子萌发期敏感的材料。

17.5% PEG-6000 胁迫处理后，63 份材料相对出苗率≥80%，为了筛选到抗旱性更强的材料，增加选择压力，采用20% PEG-6000 进一步筛选。其中15 份材料相对出苗率在80%～90.5%之间，19份材料相对出苗率在62.5%～78.5%之间，29 份材料相对出苗率＜60%。选择20% PEG-6000 胁迫下，相对出苗率≥62.5%的34 份材料作为种子萌发期的抗旱材料。

2.3 分类分析高粱种子萌发期抗旱和敏感材料

为了减少籽粒大小、籽粒用途、株高和生育期等性状对模拟抗旱鉴定的影响，利用株高和熟期对材料进行分类。26 份敏感材料中，8 份在沈阳不能正常抽穗结实，18 份材料可以正常抽穗结实。34 份抗旱材料中，12 份在沈阳不能正常抽穗结实，22 份材料可以正常抽穗结实。统计沈阳地区3 年的株高和生育期数据，以此为选择参数，将18 份敏感材料和22 份抗旱材料进行筛选，选择抽穗期差异3 d 以内，株高差异5 cm 以内，共筛选到3 组抗旱和干旱敏感的材料（图1）。3 个组合中共包含8份材料，分别统计农艺性状（表1）。组合1 中8R336（抗旱）和8R079（干旱敏感）均表现为抽穗期早、株高矮，且均为粒用高粱，可以作为优良亲本构建抗旱相关基因定位群体。组合2 中，8R199（抗旱）和8R601（干旱敏感）虽然株高和抽穗期接近，但是籽粒用途不同。组合3 中，抗旱和敏感的材料分别都有2 份，其中敏感材料8R141（干旱敏感）是粒用高粱，其它3 份为糖用高粱，抽穗期晚且植株偏高。组合1 中2 份粒用高粱和组合3 中3 份糖用高粱可以用于挖掘抗旱基因的群体构建。

图1 依据株高和抽穗期筛选22 份抗旱材料和18 份敏感材料Fig.1 Screening graph for 22 drought-resistant materials and 18 drought-sensitive materials based on plant height and heading date

2.4 不同选择压下种子萌发期抗旱性精细鉴定

为进一步验证筛选结果，利用不同胁迫处理对组合1 和组合3 中3 份抗旱材料（8R336/8R340/8R481）和 2 份敏感材料（8R079/8R078）抗旱性进行精细鉴定（图2）。15%和17.5%PEG-6000 胁迫处理下，胁迫处理对抗旱材料的相对出苗率影响较小，与对照相比下降幅度较低，8R336、8R340 和8R481 相对出苗率降低幅度分别为0.67%～6.34% 和 1.34%～11%。当 PEG-6000 处理浓度≥20%时，抗旱材料相对出苗率下降达到显著水平。然而与对照相比，15% PEG-6000 胁迫处理下，干旱敏感材料8R079 和8R078 的相对出苗率下降幅度为13%～21.5%达到显著水平，随着处理浓度的不断增大，相对出苗率下降幅度更大达到极显著水平。

组内抗旱材料和敏感材料比较，在正常水培养条件下，两者出苗率均达到90%以上且差异很小，变化范围为1.83%～2.67%。但是经过15%PEG-6000 处理后，抗旱材料和敏感材料之间差异明显，8R336/8R079、8R340/8R078 和 8R481/8R078 相对出苗率分别相差21.5%、15% 和8.33%，抗感材料相比较相对出苗率降低幅度均达到显著水平。PEG-6000 处理浓度≥17.5%时，干旱敏感和抗旱材料之间的相对出苗率差异更大达到极显著水平。当处理浓度增加到25%时，抗旱和敏感材料相对出苗率都很低，且两片子叶不能完全展开，不利于出苗率的统计。根据相对出苗率统计分析，8R336/8R079（38%、45.33%）和8R340/8R078（53%、55%）杂交亲本在 17.5% 和20% PEG-6000 胁迫处理下相对出苗率差异更大利于统计分析，可以作为最优杂交组合构建基因定位群体。

表1 抗旱和敏感材料农艺性状统计Table1 Statistic analysis of agronomic characters of drought-resistant and sensitive materials

图2 不同浓度PEG-6000 处理下，5 份高粱材料相对出苗率统计Fig.2 Relative seedling-emergence rates of five sorghum materials in the treatments with different PEG-6000 concentrations

3 讨论

植物抗旱性是一个综合性状，受遗传因素和环境条件等多重影响，在各个生长发育阶段植物表现出的抗旱能力存在显著差异，有些品种整个生长发育时期抗旱性基本不变，有些品种不同生长发育时期存在显著差异，因此明确适合作物某个发育时期或全生育期的抗旱筛选方法非常重要。高粱抗旱性研究，多数集中在开花前后和苗期［12，13］，关于种子萌发期高粱抗旱性研究相对较少。然而高粱春播遭遇干旱时，萌发期抗旱性就显得尤为重要，直接决定出苗率和群体结构的建立。

借鉴玉米、小麦和水稻等作物的研究经验［14～16］，高粱也采用种子发芽率、发芽势、萌发抗旱指数等作为萌发期抗旱筛选的评价指标。陈冰嬬等［17］以 15 份保持系、18 份恢复系和8份杂交种为材料，以PEG-6000 水溶液模拟干旱胁迫，筛选出2 份萌发期抗旱性强的高粱材料，分别为恢复系L116 和保持系 Ms27B。吴奇等［4］、王艺陶等［18］分别利用54 份、31 份高粱杂交种筛选种子萌发期抗旱的材料，最终分别获得一个抗旱性极强的杂交组合13218A×20982R 和4 个高度抗旱材料。张笑笑等［19］利用73 份高粱材料对萌发期和苗期的抗旱性进行筛选，通过室内和田间试验，最终筛选出抗旱材料1 份、敏感材料2 份。

PEG-600 是一种极为理想的渗透调节剂，可有效降低栽培基质中水势，稳定渗透压，广泛用于种子萌发期模拟干旱胁迫试验［20］。本研究团队前期在PEG-6000 模拟干旱的情况下，对全球收集的396 份高粱材料进行抗旱筛选，根据种子萌发期相对出苗率的高低为指标筛选出了4 份抗旱材料［9］，但是由于筛选群体不够大，在正常生长状态下有很高的出苗率，模拟干旱胁迫处理后，出苗率显著降低的材料不易筛选到。本试验中，将筛选群体扩大到575 份，同时选择不同的模拟干旱胁迫压力筛选抗旱和敏感材料。当选用的PEG-6000 浓度为17.5%，301 份高粱材料模拟干旱胁迫处理后，相对出苗率≥80%的抗旱材料共有63 份，相对出苗率＜40%的敏感材料共有26 份；当PEG-6000浓度降低到15%时，26 份敏感材料中11 份材料相对出苗率在80%～86.5%之间，15 份材料相对出苗率在70%～79.5%之间，不论是抗旱材料还是敏感材料相对出苗率都很高，15%PEG-6000 不适于极端材料的筛选。当PEG-6000 浓度增加到20%时，63 份抗旱材料中相对出苗率≥80%的只有15 份。本试验中，干旱敏感材料并没有只选择在15% PEG-6000 胁迫处理下相对出苗率在70%～79.5%之间的15 份材料，抗旱材料也没有只选择在20% PEG-6000 胁迫处理下相对出苗率≥80%的15 份材料，主要是由于筛选到的极端材料太少，综合考虑株高、抽穗期（在沈阳能否正常抽穗结实）、用途和籽粒大小等性状时，存在可能筛选不到理想的抗旱和干旱敏感材料用于基因定位群体的构建。综上所述，当筛选材料群体大时，重点筛选抗旱材料时，建议PEG-6000 浓度使用20%；重点筛选敏感材料时，建议PEG-6000 浓度使用17.5%。

通常情况下，PEG-6000 处理模拟的是水分渗透胁迫，与实际的土壤干旱胁迫不完全相同。因此，实验室内采用PEG-6000 模拟干旱胁迫筛选、鉴定获得的干旱敏感材料和抗旱材料，都需要在大田中进行多年多点试验反复验证，将来才有可能为高粱种子萌发期抗旱育种提供一定的依据。