低温胁迫下高粱幼苗生理变化及耐冷综合评价

周福平，王坚强，范娜，张海燕，史红梅，杨彬，张桂香

（山西省农业科学院高粱研究所/高粱遗传与种质创新山西省重点实验室，山西晋中030600）

早春冷害是高粱幼苗生长发育的主要非生物胁迫因素之一，培育广适性耐冷品种是解决高粱早春冷害的行之有效途径。明确抗冷性鉴定指标和掌握鉴定方法，可以提高高粱品种耐冷鉴定和筛选的效率，加快高粱耐冷品种的选育进程［1］。

高粱播种后，种植区域遭遇低温气候会对高粱种子的萌发、出苗和幼苗生长造成一定程度的伤害。种子萌发和高粱幼苗阶段低温冷害已经成为影响高粱产量的重要因素之一。

有关植物的耐冷性生理指标，国内学者已在黄瓜［2］、扁蓿豆［3］、水稻［4］、玉米［5］等作物上做了大量研究。我国高粱研究学者就关于高粱耐低温材料的筛选、鉴定等研究做了初步工作，之后有研究者从高粱资源中筛选出了一批耐冷材料，并从伤害率、总糖含量等方面做了一些研究［6］，表明高粱品种间耐冷性存在差异，一些生理指标的测定也有助于对高粱耐冷性的确定。

筛选耐冷高粱品种，明确高粱幼苗的耐冷生理机制，对于选育高产、稳产的耐冷型高粱种资尤为重要。关于高粱耐低温胁迫的机制以及品种间的耐冷性比较的研究鲜见报道，本研究通过对高粱幼苗进行2 ℃低温胁迫的不同时间处理，检测分析幼苗叶片中的 SOD 活性、POD 活性、MDA 含量、Pro 含量，比较不同品种间耐冷响应机制，建立多因素高粱耐冷种质鉴定综合评价指标，为耐冷高粱品种的选育及高粱耐冷性科学鉴定提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2018 年在山西省农业科学院高粱所实验室进行。选择2 个耐冷品种（2 ℃下，死苗率为≤15%，为耐冷材料）“冻高粱”和“红壳四号”和2 个冷敏品种（2 ℃下，死苗率为≥80%，为冷敏材料）“SC407”和“晋 303”为试验材料。2017 年在山西省农业科学院高粱所实验室进行高粱品种耐冷性鉴定结果如表1 所示。

表1 高粱品种耐冷性鉴定结果Table 1 Identification results of cold tolerance of sorghum lines

1.2 试验方法

将参试材料种于发芽盒内，3 次重复。置于适宜高粱生长的室外环境中，常温下统一管理，待高粱长出三叶一心后，选取大小一致的幼苗，把发芽盒中完整植株置于胁迫温度2 ℃的培养箱中进行低温处理，胁迫处理时间分别为12、24、36 h，以室外生长的材料作为对照。每个处理分别取高粱幼苗 0.2 g，进行 MDA 含量、SOD 活性、POD 活性、Pro 含量等4 项生理指标的测定。

1.3 生理指标及测定方法

参照任红旭等［7］方法提取酶液，参照高俊凤［8］的氮蓝四唑（NBT）还原法测定SOD 活性。

POD 活性测定采用愈创木酚法，参照高俊凤［8］的方法进行。

MDA 含量测定用硫代巴比妥酸（TBA）显色法，参照王学奎［9］的方法进行。

Pro 含量测定方法采用茚三酮方法［10］。

1.4 耐冷性综合评价方法

隶属函数平均值法是植物抗逆生理实验中常用的一种方法，可用于多指标的综合评价，能消除个别评价指标评价的片面性，使供试材料的耐冷性差异具有可比性，对于反映植物的抗逆性更为合理准确。隶属函数平均值U 越大，说明植物的耐冷性越强［11］。

耐冷系数=胁迫后的测量值/对照的测量值

与耐冷性呈正相关的参数POD、SOD 和Pro隶属函数采用公式：

与耐冷性呈负相关的参数MDA 隶属函数采用公式：

式中，Uij为 i 品种 j 指标的隶属函数值；Xij为 i 品种 j指标的耐冷系数；Xmax为所有品种中此指标的最大值；Xmin为所有品种中此指标的最小值。Ui是为i品种的各性状的平均耐冷隶属函数值。

参考宋广树［12］水稻耐冷性综合评价标准，确定高粱品种耐冷分级标准：U≥0.7 为耐冷品种，0.4≤U＜0.7 为中等耐冷品种，U＜0.4 为冷敏品种。

1.5 数据处理

所得试验数据运用DPS 10.5 和Excel 2007 软件进行数据统计分析，多重比较采用LSD 法（P＜0.05 和P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 各生理指标的基本统计分析

表2 为4 个高粱品种不同时间低温胁迫下各生理指标性状的平均数、极差、变异系数、最大值、最小值的统计参数。

由表2 可知，供试品种的MDA 含量最小为6.737 μmol·g-1，最 大 为 23.425 μmol·g-1；POD 活性 最 小 为 2.968 U·min-1·g-1，最 大 达 5.335 U·min-1·g-1；SOD 活性最低为 315.328 U·g-1，最高为878.747 U·g-1；脯氨酸含量最低为 1.167 mg·g-1，最高达 2.147 mg·g-1。

同时可以看出，供试品种的变异系数存在较大差异在15.4%～39.8%之间变化，其中，MDA含量、SOD 活性和游离脯氨酸变异系数较大，在25.4%～39.8%之间，变异系数的变化区间大反映了性状指标存在的差异大。POD 活性的变异系数中等（15.4%）；表明参试品种的POD 活性差异较小。以上数据分析显示，不同时长的低温胁迫处理对高粱品种耐冷性影响存在着较大变异。

表2 不同低温胁迫时间高粱苗期生理指标性状Table 2 Physiological indices in sorghum seedlings under different low temperature stress periods.

2.2 低温胁迫各生理指标的方差分析

4 个高粱品种的4 个生理指标各性状在处理间、品种间、低温胁迫时间均达到了显著或极显著水平，品种×低温胁迫时间之间的互作的未达到差异显著（表3）。不同低温胁迫时间处理间的MDA 含量、SOD 活性差异极显著（P＜0.01），POD 活性差异达到显著水平（P＜0.05），脯氨酸差异不显著。品种处理间和低温胁迫时间处理间的 2 个生理指标（MDA 含量、SOD 活性、POD 活性）差异极显著（P＜0.01），而脯氨酸含量差异不显著。

表3 不同低温胁迫时间对高粱苗期生理指标的方差分析Table 3 Variance analysis of physiological indexes of sorghum seedlings under different low temperature stress time

2.3 低温胁迫对高粱幼苗MDA 含量的影响

MDA（丙二醛）是膜脂过氧化作用的最终产物。随着低温胁迫时间的延长，12、24、36 h 低温处理的冷敏品种“晋 303”、“SC407”和“冻高粱”的MDA 含量与CK 处理差异达显著水平，且耐冷品种“冻高粱”不同时间低温处理间差异显著，36 h 低温胁迫处理的耐冷品种“红壳四号”和“冻高粱”与对照相比差异达显著水平（表4）。随着处理时间的延长，高粱耐冷和冷敏品种的幼苗MDA 含量均呈增高趋势，而且胁迫前期上升速度较快，随着低温胁迫时间延长上升速度延缓。低温胁迫后期，上升的幅度品种间有明显差异，冷敏品种“晋303”和“SC407”上升平均幅度较大，分别为158.2%、133.6%，远远高于耐冷品种“红壳四号”和“冻高粱”上升平均幅度，分别为58.9%、80.0%，且冷敏品种的MDA 含量始终高于耐冷品种（图1）。

2.4 低温胁迫对高粱幼苗POD 活性的影响

随着低温胁迫时间的延长，冷敏品种POD 活性各低温处理间差异不显著，耐冷品种与对照相比，12、36 h 处理差异均达显著水平（表5）。由此表明冷敏品种在低温胁迫下，POD 活性增加不明显，而耐冷品种随低温胁迫时间的延长，POD 活性比对照有明显提升，这样在一定程度上帮助高粱幼苗调节细胞膜透性，防止膜受损伤，从而提高了高粱幼苗的低温适应能力。

2 类高粱材料的幼苗POD 活性随低温胁迫时间的增加，呈现先升高后降低的变化趋势，耐冷品种和冷敏品种幼苗在低温胁迫12 h 内，POD 活性均增至最高值，其平均增幅分别为53.6%、31.8%，然后开始下降，在随后36 h 内，活性平稳下降，但与对照相比，仍维持在高于对照的水平（图2）。耐冷品种的峰值、24 h 的值、36 h 的值均高于冷敏品种。

表4 不同高粱品种不同时间叶片MDA 含量变化Table 4 Changes of MDA in leaves of different sorghum lines at different time 单位：μmol·g-1

图1 低温下不同处理时间对高粱苗期MDA 含量的影响Fig.1 Effect of different treatment time on MDA content of sorghum seed seedings

表5 不同高粱品种不同时间下叶POD 活性变化Table 5 Changes of POD activity in leaves of different sorghum lines at different time 单位：U·min-1·g-1

2.5 低温胁迫对幼苗SOD 活性的影响

随着低温胁迫时间的延长，SOD 活性变化冷敏品种“SC407”的对照、12、24、36 h 处理间差异不显著，“晋303”与对照相比12、36 h 差异均达显著水平，12 h 与36 h 处理间差异也达显著水平，其余处理间差异呈不显著水平；而耐冷品种“红壳四号”和“冻高粱”与对照相比12 h 差异达显著水平，其余处理间差异不显著（表6）。

耐冷和冷敏两类高粱品种的幼苗叶片SOD 与POD 活性低温胁迫处理的变化趋势基本一致，活性峰值出现的低温胁迫时间相同，其平均增幅分别为43.5%、37.3%，且低温处理后的POD 活性增幅高于SOD 活性增幅，表明2 种酶对低温胁迫有着不同的响应机制（图3）。

图2 低温下不同处理时间对高粱苗期POD 活性的影响Fig.2 Effect of different treatment time on POD activity of sorghum seedlings

表6 不同高粱品种不同时间下叶SOD 活性变化Table 6 Changes of SOD activity in leaves of different sorghum lines at different time 单位：U·g-1

图3 低温下不同处理时间对高粱苗期SOD 活性的影响Fig.3 Effect of different treatment time on SOD activity of sorghum seedlings.

2.6 低温胁迫对幼苗Pro 含量的影响

方差分析显示，2 类高粱品种的Pro 含量不同时间低温胁迫处理间差异均未达到显著。由图4可知，随低温胁迫时间延长，2 种材料高粱品种幼苗叶片的Pro 含量变化均为升高趋势，冷敏品种其上升平均幅度分别为21.1%、18.3%，耐冷品种其上升平均幅度分别为75.2%、41.3%，耐冷高粱幼苗的Pro 含量始终高于冷敏品种（表7）。由此表明，高粱幼苗Pro 含量与耐冷性成正比，遇冷胁迫可以通过生理机制增高脯氨酸含量来提高自身的抗寒性。

图4 低温下不同处理时间对高粱苗期pro 含量影响Fig.4 Effect of different treatment time on Pro content of sorghum seedlings.

表7 不同高粱品种不同时间下Pro 含量变化Table 7 Changes of proline content in leaves of different sorghum lines at different time 单位：mg·g-1

2.7 低温胁迫下12 h 高粱品种的各种生理指标隶属函数及综合评价

试验中由于 12 h 处理时的 SOD 活性、POD 活性最大，因而，计算4 种生理指标的隶属函数值时采用12 h 的各项值进行。对低温胁迫下12 h 内的高粱生理指标平均隶属函数值进行综合评价，U值越大，表示高粱幼苗的耐冷性越强。低温胁迫下4 个高粱品种耐冷性U 值排序为：SC407＜晋303＜红壳四号＜冻高粱。这与低温下筛选结果基本一致，说明隶属函数综合评价法可以应用于耐冷筛选（表8）。

3 讨论与结论

植物在逆境胁迫时可以通过自身生理功能调节细胞内生理生化代谢，包括各种保护酶活性以及对抗逆境的生理物质含量的调整，从而降低逆境条件下代谢过程产生的有害物质对植物的伤害，有效保护植株正常生长发育［13，14］。研究表明，遇冷胁迫时抗寒性较强的作物，其自身SOD 和POD 等保护酶仍能维持正常生理机能，冻害、冷害产生的毒害代谢物会被高活性的酶系统分解，减少和缓解了由膜脂过氧化所引起的膜伤害，从而增加了机体的抗寒能力［15～17］。由于低温胁迫 ，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏从而有利于活性氧的产生。活性氧过剩的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤。因而作为膜脂过氧化产物，MDA 含量变化是质膜损伤程度的重要标志之一［16］。游离脯氨酸是植物细胞内重要的渗透调节物质，能增加胞内溶质浓度，降低细胞的冰点，防止细胞过度脱水，从而减少低温对细胞的伤害［18］。

本试验以高粱耐冷和冷敏品种为试验材料，对高粱苗期叶片低温胁迫下不同时间的MDA 含量、SOD 活性、POD 活性等与耐冷性有关的生理指标进行分析测定，较为系统地研究和筛选高粱苗期耐冷性鉴定指标，完善高粱耐冷性评价机制，建立高粱耐冷性种质多项生理指标综合评价体系，为耐低温高粱品种的筛选提供依据，为更好更快对高粱耐冷资源进行有效利用奠定基础。结果表明，低温胁迫后，耐冷和冷敏材料的MDA 含量、SOD 活性、POD 活性及Pro 含量都出现了增高的趋势，耐冷材料的 SOD 活性、POD 活性和 Pro 含量的增加显著高于冷敏材料，而MDA 含量却是冷敏材料的增加高于耐冷材料，这与张桂香［19］、马艳青［20］、马智宏［21］、廖启［22］和曾智驰［23］等的研究结果一致。

表8 12 h 低温胁迫高粱苗期生理指标隶属函数值、U 值及耐冷综合评价Table 8 Membership function value of physiological indexes of sorghum seedlings under 12-hour low temperature stress，U value and comprehensive evaluation of cold tolerance

本试验认为单一逆境生理指标无法准确判断植物遇冷的综合适应能力，只有采用多项生理指标的进行隶属函数值的综合评价，才能比较准确地反映品种的耐冷水平。本试验确定丙二醛、过氧化物酶、脯氨酸和超氧化物歧化酶4 个生理指标可以为高粱耐冷性鉴定指标，隶属函数对高粱幼苗耐冷性综合评价科学有效。